湿式粉砕技術としてのナノ秒レーザーアブレーションによって生成されたメロキシカム粒子の包括的な分析

Rapporti scientifici Volume 12,

Scientific Reports volume 12、記事番号: 12551 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

最近、水に不溶性および難溶性の薬物化合物の数が大幅に増加しています。したがって、薬物の溶解速度、輸送特性、生物学的利用能を改善するためのさまざまな粒子サイズ縮小技術への関心の高まりが見られています。レーザーアブレーションは、大きな化学的損傷を与えることなく、ナノおよびマイクロメートルサイズの薬物粒子を製造する代替方法であることが証明されています。我々は、水難溶性の非ステロイド性抗炎症薬であるメロキシカムをターゲットとして、異なるレーザー波長（248 nm、532 nm、1064 nm）で、蒸留水中の薬物トローチのナノ秒レーザーアブレーションを紹介します。化学的特性、結晶化度、形態および粒子サイズの研究に加えて、粒子生成プロセスのメカニズムが検査されました。薬物製剤におけるアブレーション粒子の適用性は、溶解度、細胞毒性、および抗炎症効果の測定によって調査されました。私たちは、レーザーアブレーションが、メロキシカム粒子のサイズをサブマイクロメートルから数マイクロメートルのサイズ範囲に縮小するためのクリーンで効率的かつ化学的損傷のない方法であり、肺への薬物送達に最適であることを示しました。レーザーアブレーションは、最初の薬剤と比較して粒子の優れた溶解性（4 ～ 9 倍高い）と抗炎症性（4 ～ 5 倍優れている）特性によって補完され、製剤の開発においてより幅広い用途があると予測されています。

難溶性の薬剤が市販されている薬剤の約 40%、候補化合物の 90% を占めているため、製薬業界では溶解性への関心が高まっています1。この傾向は、さまざまな製剤および投与戦略の開発に影響を与えました2。溶解性と生物学的利用能を高めるための最も簡単な物理的方法の 1 つは粒子サイズの縮小です 3,4。その技術は、a) 従来型: 粉砕 6,7、噴霧乾燥 8、高圧均質化 7 または b) 非従来型: 液体アンチウイルスとして分類できます 5。 - 溶媒結晶化9、スプレー凍結乾燥10、超臨界流体ベースの微粉化プロセス11、およびパルスレーザーアブレーション12、13、14、15。

パルスレーザーアブレーションは、真空、気体、または液体中でさまざまなターゲット材料に使用できる柔軟な材料加工技術です。これは、さまざまなナノ材料の合成に広く適用されています16、17、18、19。レーザーアブレーションは化学薬品を使用せず、広範囲のパラメーターにわたって正確に制御できる技術であるため、生命科学にとっても魅力的な技術となっています。薬物粒子はレーザーアブレーションによって細断され、元の（合成された）粒子のサイズがナノメートルからマイクロメートルのサイズ範囲まで縮小されることが示されました12、13、14、15。

本研究は、液中パルスレーザーアブレーション (PLAL)12 を用いたメロキシカム懸濁液製造に関する我々の以前の研究を補完するものである。 3 つの異なるレーザー波長が使用され、切除された粒子の構造と組成に加えて、その溶解性、細胞毒性、抗炎症活性が研究され、元の薬剤と比較されました。根底にあるプロセスを理解するために、私たちは薬物トローチのアブレーションを高速写真で追跡しました。

メロキシカム (Mx.) (4-ヒドロキシ-2-メチル-N-(5-メチル-2-チアゾリル)2H-ベンゾチアジン-3-カルボキサミド-1,1-ジオキシド) は、EGIS Ltd. (ブダペスト) から入手しました。、ハンガリー）99％以上の医薬品グレードおよびd（0.5）= 27.52μmの中央粒径を有する100％結晶性粉末形態。

純粋なメロキシカム標的は、KORSCH EK-0 錠剤プレス機 (KORSCH AG-ベルリン、ドイツ) で 15 kN の圧縮力を使用して、300 mg のメロキシカム粉末を直径 9 mm の錠剤に圧縮することによって製造されました。

KrF エキシマレーザー (LLG Twinamp、λ = 248 nm、FWHM = 18 ns、f = 10 Hz) および周波数 2 倍 Q スイッチ Nd:YAG レーザー (Quantel、λ = 532 nm/1064 nm、FWHM = 6 ns、 f = 10 Hz) は、紫外から可視、赤外領域までの 3 つの波長でナノ秒パルスを提供しました。

セットアップは 3 つの波長すべてで同じでした (図 1)。レーザービームは石英レンズを通過し、10 ml の蒸留水が入った回転ガラスビーカーに置かれたターゲットの表面の直下に焦点を合わせました。ターゲット表面は水面から約 5 mm 下でした。スポットサイズは〜0.6 mm2、パルスエネルギーはλ = 532 nm/1064 nmで〜60 mJ、λ = 248 nmで〜0.3 mm2と〜30 mJでした。アブレーションフルエンスはすべての場合で 9.4 J/cm2 で、特定の測定に必要なアブレーション粒子の量に応じて、約 36,000 または 72,000 のレーザーパルスが使用されました。アブレーション後、得られた懸濁液を篩（孔径 300 μm）で濾過し、レーザーアブレーション粒子の分析に影響を与えないように、フレーク状の錠剤片を除去しました。

液体パルスレーザーアブレーション (PLAL) の実験装置。

懸濁液の水分を実験用オーブン (CARBOLITE 2416、Thermal Engineering Services Ltd.、英国ウースター) 内で 50 °C で 12 時間以内に蒸発させ、残った粉末を FTIR サンプル調製に使用しました。数ｍｇの乾燥粒子を１５０ｍｇのＫＢｒと混合し、この混合物をアハ酸乳鉢で粉砕し、ＦＴＩＲ分析用に１０ｋＮで直径１３ｍｍのディスクにプレスした。

FTIRスペクトルは、AVATAR 330 FTIR分光計（Thermo Nicolet、LabX Midland、ON、カナダ）を使用して、4000〜400 cm-1の範囲で4 cm-1の分解能で、ベースライン補正を使用して平均128スキャン/測定で記録しました。

ラマン分光法の研究では、FTIR 測定の場合と同じ乾燥粉末を少量使用しました。 Thermo Scientific™ DXR™ ラマン顕微鏡 (Thermo Fisher Scientific Inc.、米国マサチューセッツ州ウォルサム) は、2 mW のレーザー出力および約 3.1 µm のスポットサイズで励起するため、λ = 780 nm のレーザー波長で操作されました。ラマンスペクトルは、400 本/mm の回折格子を使用して 2500 および 500 cm-1 の波数範囲で記録されました。解像度は4.7〜8.7cm−1でした。すべてのスペクトルは 2 秒の積分時間で 20 回記録されました。

HPLC-MS は、アブレーション製品の分離と同定に使用されました。アブレーション後、得られた懸濁液を 50 °C の実験用オーブンで蒸発させて 1 ～ 2 ml に濃縮しました。次いで、５ｍｌのアセトニトリルを加えて固体粒子を溶解した。 HPLC-MS 分析の前に、各サンプルをシリンジフィルター (平均細孔直径: 0.22 μm) で濾過しました。

Agilent 1100 HPLC システムには、ダイオードアレイ検出器 (DAD) および Agilent LC/MSD/VL 質量分析計 (MS) (Agilent Technologies、米国カリフォルニア州パロアルト) が装備されていました。分離は、35 °C に温度調節された Kinetex 2,6u XB-C18 100A (Phenomenex) カラムを使用して実行されました。溶離液は、40 v/v% メタノールおよび 60 v/v% 水とギ酸 (0.1 v/v%) から構成されました (流速 0.80 ml min-1)。検出波長は210nmと350nmでした。 MS 測定は、陽イオンモードのエレクトロスプレーイオン化 (ESI) を使用して実行され、300 °C の窒素乾燥ガス、3500 V のキャピラリー電圧、および 50 V のフラグメンター電圧が適用されました。懸濁液のメロキシカム濃度は、検量線を使用して HPLC-MS によって決定されました。一次検量線 (R2 = 0.991) は、50 ～ 500 mg/dm3 の範囲の純粋なメロキシカム溶液を使用して決定されました。

結晶化度の研究には、50 °C で 12 時間乾燥させた後に懸濁液から得られた粉末を使用しました。我々は、BRUKER D8 Advance X 線粉末回折計 (Bruker AXS GmbH、カールスルーエ、ドイツ) と Cu K λI 放射線 (λ = 1.5406 Å) および VÅNTEC-1 検出器を使用し、サンプルを 40 kV および 40 mA でスキャンしました。 2θ角度範囲は3°～40°、スキャン速度は0.1秒/ステップ、ステップサイズは0.0074°です。

形態と粒子サイズは走査型電子顕微鏡 (SEM) によって研究されました。切除後、撹拌した懸濁液を一滴シリコンプレート上に置きました。イメージングの前に、液滴を乾燥させ、次にスパッターコーター (Bio-Rad SC 502、VG Microtech、アックフィールド、英国) を使用して金でコーティングしました。 SEM 研究は、Hitachi S-4700 SEM システム (Hitachi S4700、Hitachi Scientific Ltd.、東京、日本) を使用して実行されました。

粒子の生成プロセスを説明するために、高速撮影に適したポンプ/プローブシステムを構築しました (図 2)。

直接プローブ照明 (青い点線) を使用した高速撮影用のポンプとプローブのセットアップ、または 2 つのプローブパルスによる二重露光用のマイケルソン干渉計で拡張したポンププローブセットアップ。

SEM 画像は、粒子の製造プロセスがアブレーション波長とは無関係であることを示唆しました。研究のために、Nd:YAG レーザー (Quantel、λ = 532 nm/1064 nm、FWHM = 6 ns) がポンプ (アブレーション) 光源として選択されました。 λ = 532 nmでは、スポットサイズは〜0.2〜0.3 mm2、パルスエネルギーは〜6〜8 mJおよび〜12〜16 mJで、それぞれF = 3 J/cm2およびF = 6 J/cm2のフルエンスとなりました。。 λ = 1064 nm では、スポットサイズは約 0.07 ～ 0.09 mm2、パルスエネルギーは約 15 mJ で、フルエンス F = 18 J/cm2 となりました。 (視野内に収まるように、スポットサイズはサンプル生成実験と比較して縮小されました。) プローブビームとして、窒素レーザー誘起ローダミン 6G 色素レーザーを使用しました (λ = 590 nm、FWHM = 1 ns)。プローブレーザービームは、光ファイバーによってアブレーションセットアップに輸送され、直接ターゲットに転送されるか、8 ns の時間間隔で 2 つの連続したプローブパルスを提供するマイケルソン干渉計を介して転送されます。直接照明は粒子生成の時間的発展を調査するために使用されましたが、2 つのプローブパルスを使用した目的はアブレーションプロセスの初期の一時的な部分を研究することでした。ポンプと最初のプローブパルスの間の時間遅延は、フォトダイオードを使用して監視されました。ポンプパルスは上からターゲットに当たり、プローブパルスは側面 (照射面の接線方向) から照射し、CCD カメラ (イメージングソース-DMK 23G445、30 fps、N) にアブレーションプロセスの影画像を投影します。 = 3 ×)。生成されたプラズマの光は、カメラの前に配置されたバンドパス光学フィルターによって除去されました。ナノ秒からミリ秒の範囲の遅延を伴うポンプレーザー、プローブレーザー、および CCD カメラの個別のトリガーは、デジタル遅延発生器 (DDG) (Stanford Research Systems-DG645) によって制御されました。

溶解度測定は、AvaSpec-2048L プローブと AvaLight DH-S-BAL 分光光度計を使用して、室温 (22 °C) で 24 時間かけて、10 ml のリン酸緩衝溶液 (pH = 7.4) 中で実行されました (オランダ、アペルドールン、アバンテス）。各サンプル溶液をろ過（フィルター平均孔径：0.45μm）し、必要な希釈を行った後、λ=362nmで吸光度を測定し、メロキシカム濃度を算出した。

懸濁液を乾燥（50℃、12時間）した後、1 mgの固体残留物を、10％体積を補充したアール塩を含む最小必須培地イーグル（Sigma、セントルイス、ミズーリ州、米国）1 mlに再懸濁しました。 /vol ウシ胎児血清、0.5% wt/vol グルコース、0.3 mg の l-グルタミン ml-1、4 mM HEPES および 25 μg のゲンタマイシン ml-1。

細胞生存率を特徴付けるために、MTT (3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド) アッセイを使用してミトコンドリア活性を測定しました。これらの実験では、A549 (腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞) (ATCC) を使用し、4∙104 細胞/ウェルの密度で播種しました。細胞は、248、532、または1064 nmの波長でメロキシカムトローチのレーザーアブレーションによって生成された粒子を含むサンプルで処理されました。化合物の 2 倍連続希釈物は最大化合物濃度 1 mg/ml で調製され、細胞毒性は 37 °C で 24 時間のインキュベーション時間で測定されました。次のステップとして、20μlのチアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド(MTT; Sigma、米国ミズーリ州セントルイス)を各ウェルに添加した。さらに３７℃で４時間インキュベートした後、ドデシル硫酸ナトリウム（米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ）溶液（０．０１ＭＨＣｌ中１０％）を添加し、一晩インキュベートした。最後に、細胞毒性は、EZ READ 400 ELISA リーダー (Biochrom、ケンブリッジ、英国) を使用して 550 nm (参照: 630 nm) での光学密度 (OD) 測定によって決定されました。各濃度でアッセイを 4 回繰り返しました。細胞の生存率は次の式に基づいて判断されました: \({1}00 - \left( {\left( {{\text{OD}}_{{{\text{sample}}}} - {\text{OD }}_{{{\text{medium}}\;{\text{ control}}}} } \right) / \left( {{\text{OD}}_{{{\text{cell }}\ ;{\text{control}}}} - {\text{OD}}_{{{\text{medium}}\;{\text{ control}}}} } \right)} \right) \times { 1}00\) 。

抗炎症効果を観察するために、A549 細胞を 1∙106 細胞/ウェルの密度で 6 ウェルプレートに播種し、5 μg/ml リポ多糖 (LPS; ThermoFisher Scientific Waltham、MA、USA) と 5 μg/ml のリポ多糖の混合物で処理しました。アブレーションされた粒子の溶液、または 5 μg/ml LPS (ポジティブコントロール) で処理、または未処理のままにします。溶液中の粒子濃度は、前のセクションで説明した細胞毒性測定で決定された最大の非毒性濃度となるように選択されました。 248 nm、532 nm、および1064 nmでのアブレーションによって生成された粒子の無毒性濃度は、それぞれ0.125 mg/ml、0.016 mg/ml、および0.125 mg/mlと測定されました。

製造業者の指示に従って、ＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州、米国）を利用して２４時間の処理後にＲＮＡを抽出した。その後、メーカーのプロトコールに従って Maxima Reverse Transcriptase を使用し、Random Hexamer プライマー (Thermo Fisher Scientific、Waltham、Massachusetts、USA) を適用して 2 μg の RNA を逆転写しました。

qPCR では、Bio-Rad CFX96 リアルタイムシステムを 5 × HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Supermix (Solis BioDyne、タルトゥ、エストニア) およびリストされたヒト特異的プライマーペアとともに使用しました: IL-6: 5'-CAGCTATGAACTCCTTCTCCAC- 3'、および 5'-GCGGCTACATCTTTGGAATCT -3'; Actb: 5'-TTCTACAATGAGCTGCGTGTGGCT-3' および 5'-TAGCACAGCCTGGATAGCAACGTA -3' プライマーは、Primer Quest Tool ソフトウェアを使用して設計され、Integrated DNA Technologies Inc. (モントリオール、ケベック、カナダ) によって合成されました。増幅特異性を検証するために、融解曲線分析を実行しました。 IL-6およびActbについて閾値サイクル(Ct)を決定し、相対的な遺伝子発現を2-(ΔΔCt)法で計算した。反復測定による一元配置分散分析 (ANOVA RM) と計画された比較を適用して、以前に詳述したように、P < 0.0520 の有意水準で、処理サンプルと対照サンプル間の log2(ΔΔCt) 値の統計的差異を比較しました。

24 時間の処理後、細胞の上清を収集し、標準サンドイッチヒト IL-6 ELISA キット Legend Max™ (BioLegend、米国カリフォルニア州サンディエゴ) を製造者の指示に従って使用して、IL-6 濃度を測定しました。 LPS 処理細胞の上清を 10 倍に希釈しました。キットのダイナミックレンジは 7.8 ～ 500 pg/ml でした。 Biochrom Anthos 2010 マイクロプレートリーダー (Biochrom、ケンブリッジ、英国) を使用してプレートを分析しました。サンプルを二重に分析した。

レーザーアブレーションによって生成された粒子の化学組成を決定するために、FTIR、ラマン、および HPLC-MS 研究が実行されました。

指紋領域 (1800 ～ 400 cm-1) を比較することにより、アブレーションされた粒子の FTIR スペクトルが、すべてのアブレーションレーザー波長の基準メロキシカムスペクトル (Mx. ref.) と同一であることがわかりました (図 3)。ピークは予想された波数で現れ、ピーク強度比は同じでした。

異なる波長（248 nm、532 nm、1064 nm）およびメロキシカム（Mx. ref.）でPLALによって調製された粒子のFTIRスペクトルのフィンガープリント領域。すべてのスペクトルは、約 1550 cm-1 のピークに対して正規化されました。

同様に、PLAL で生成した粒子のラマンスペクトルは、適用したすべての波長で最初のメロキシカム粉末 (Mx. ref.) のスペクトルと一致しました (図 4)。したがって、ラマンの結果は FTIR の結果と一致しました。

PLAL によって異なる波長 (248 nm、532 nm、1064 nm) およびメロキシカム (Mx. ref.) で調製された粒子のラマンスペクトル。すべてのスペクトルは、約 1530 cm-1 のピークに対して正規化されました。

また、アブレーションされた材料を HPLC-MS で分析し、生成物とその相対量を特定しました。

すべての波長において、アブレーションによって生成された物質のほとんどはメロキシカムでした。質量スペクトルでは、メロキシカム (C14H13N3O4S2、図 5a) のほかに、メロキシカム不純物 B21、22、23 として知られる生成物 C4H6N2S (図 5b) が見つかりました。メロキシカム不純物 B はメロキシカム分子の一部であり、医薬品の一次標準として分類されています 24,25。 3 つのアブレーション波長すべてについて、Mx のピーク面積は次のようになります。不純物 B はメロキシカムのピーク面積の 5% 未満でした (図 5c)。さらに、少なくとも 3 つのおそらく芳香族生成物が比較的小さなピーク面積で存在していました。

(a) メロキシカムおよび (b) メロキシカム不純物 B の化学構造とイオン質量。(c) メロキシカムと比較したメロキシカム不純物 B の相対ピーク面積 [(AreaImpurity/AreaMeloxicam) × 100%] および (d) メロキシカム濃度(HPLC-MS 法によって決定) 調査した波長 (248 nm、532 nm、1064 nm) の場合。

各波長で約 36,000 回のレーザーパルスによって得られた懸濁液中のすべての粒子を溶解した後、メロキシカム濃度は、248 nm、532 nm、および 1064 nm のレーザー波長で 203.56 ± 27.30、246.32 ± 58.57、および 242.92 ± 4.90 mg/dm3 と測定されました。、それぞれ（図5d）。これらの濃度は、メロキシカムの収量が適用されたすべての波長で同程度であることを示しています。

生成した粒子の結晶性をX線回折法により分析しました（図6）。私たちのサンプルの XRPD パターンは、元のメロキシカム粉末 (Mx. ref.) のスペクトルと一致し、アブレーションによって結晶構造が変化しなかったことを示しています。これは、レーザーアブレーションで生成された粒子が市販のメロキシカム粉末とほぼ同じ結晶化度を有することを証明しました。

異なる波長（248 nm、532 nm、1064 nm）およびメロキシカム（Mx. ref.）でのPLALによって調製された粒子のXRPDスペクトル。スペクトルは 25.94°のピークに対して正規化されました。

形態と粒子サイズは SEM によって調査され、いくつかの典型的な画像が図 7 に示されています。PLAL で生成された粒子は細断された結晶片に似ており、機械的破砕が関連するサイズ縮小効果である可能性があることを示しています。 UV アブレーション (λ = 248 nm) の場合、再結晶化した材料の島がシリコンプレート上に膜状構造を形成しました。

市販のメロキシカム粉末 (Mx. ref.) と 248 nm、532 nm、および 1064 nm で PLAL によって生成された粒子の SEM 画像。倍率: (a) – (d): 500; (e)-(h): 1 k; (i)-(l): 10k。

市販のメロキシカム粉末と比較して、調査したすべての波長で大幅なサイズ縮小が達成されました。アブレーションされた粒子のサイズは、数百ナノメートルから数マイクロメートルの範囲でした。定量分析は、QuPath-0.3.1 ソフトウェアを使用して実行されました。液滴の乾燥中に粒子が束になって重なり合ったので、評価は困難でした。したがって、粒子境界は SEM 画像で個別に決定されました。各サンプルの場合、約 10 mm2 の画像領域が分析されました。近似として、各粒子が覆う面積を決定した後、画像内で輪郭を描いた粒子に等しい面積の円を割り当て、サイズ分布図をプロットする際に各円の直径を粒子サイズの特性パラメーターとして使用しました (図8）。

248 nm、532 nm、および 1064 nm の波長でのレーザーアブレーションによって生成された粒子のサイズ分布。 (y 軸のスケールが異なることに注意してください)。

以前に提案されたように 12、液体中でのパルスレーザーアブレーションによるメロキシカム粒子の生成は、次の一連のステップで説明できます。 1. パルスエネルギーはターゲットの表層の少量に吸収されます。 2. 温度が急激に上昇し、最上部のメロキシカムが蒸発して分解し、爆発的なガスの放出とプラズマの膨張が起こります。 3. 反動力が発生し、部分的に溶けた固体の粒子が残りの表面から引きはがされます。粒子が液体媒体中に蓄積すると、既に分散した粒子にレーザーパルスが照射されると、「二次」断片化が発生する可能性があります。私たちの場合、粒子濃度が低く、またフルエンスがアブレーション閾値に達するのは焦点の近くだけであるため、この効果は顕著ではありません。

レーザーパルスの衝突後の50nsから2msまでの期間は、λ=532nmのポンプパルスと直接プローブ照明を使用して調査されました。プラズマの輝きを最小限に抑えるために、粒子の形成がすでに観察される可能な限り低いフルエンスを見つけようとしました。

デモンストレーションの目的で、3 J/cm2 では、膨張するプラズマによって誘発された波面のみが表示され、材料の放出はありませんでした (図 9)。

蒸留水中でのメロキシカムのパルスレーザーアブレーション (λ = 532 nm、F = 3 J/cm2) の高速写真画像。

ImageJ で画像を評価した後、時間の経過に伴う表面からの波面の距離をプロットし (図 10)、データ点を線形関数でフィッティングしました。傾きについては v = 1490.0 ± 9.5 m/s が得られましたが、これは水中を伝播する音速 vw = 1480 m/s (T = 20 °C) をわずかに上回るだけであり、観測された波はむしろ音響的なものであることを示しています。衝撃波。これは、たとえ膨張するプラズマによって引き起こされた最初の衝撃波があったとしても、それらはすぐに減衰することを意味します。

時間の関数として表した、トローチ表面からの波面の距離。データ点は高速写真測定によるものです (λ = 532 nm、F = 3 J/cm2)。

フルエンスを 6 J/cm2 に上げて衝撃波の寿命を延ばそうとしましたが、それでも衝撃波は検出されませんでした。一方で、私たちは激しい物質の排出を目撃しました。

水中でのパルスレーザーアブレーションのプロセスでは 3 つの主要な段階を区別できます。これは、高速撮影画像ではっきりと見ることができます (図 11)。最初の数百ナノ秒で、波面が媒質内を伝播します (図 11a ～ c)。メインフロントは、ターゲット表面上のさまざまな点状の発生源から発生する多数の小さな波の合計です。これらの波の干渉と、いくつかの放出された粒子上での散乱も見られます。さらに、温度の上昇による媒質の反射率の変化も、主波面の後ろの縞に寄与する可能性があります。

蒸留水中のメロキシカムの PLAL (λ = 532 nm、F = 6 J/cm2) の高速撮影画像。 (a) – (c) 波面の形成と伝播。 (d) – (g) 粒子放出の増加に伴うキャビテーション気泡の反発ダイナミクス。 (h) キャビテーション気泡の崩壊と水中での粒子の放出/分散。

第 2 段階は数マイクロ秒から数百マイクロ秒続き、キャビテーション気泡の形成とサイズの変化が含まれます (図 11d–g)。このキャビテーション気泡の繰り返しの跳ね返りは、液体中でのレーザーアブレーションによる金属 (銅) ナノ粒子の形成に関する気泡力学の枠組みで以前に説明されています 26。生成された粒子は主にキャビテーション気泡内に存在しますが、気泡が脈動するにつれて、より多くの粒子が放出されます。小さな気泡が発生し、単独で、または粒子が付着した状態で液面に上昇します。以前の出版物 27 とは対照的に、おそらく適用されるアブレーション周波数が小さいため、持続的なガス泡の存在は私たちの設定では一般的ではありません。

最後に、第 3 段階では、数ミリ秒後、キャビテーション気泡が小さな気泡に分裂して水面に上昇し、キャビテーション気泡に閉じ込められたすべての粒子が水中に分散されます (図 11h)。同様のメカニズムがさまざまなターゲットや液体に対して示されています 28、29、30。

初期衝撃波を検出できるようにセットアップと設定を最適化しました。光ファイバーからプローブパルスがマイケルソン干渉計に導かれ、一定の時間間隔で 2 つのプローブパルスが提供されました。この配置により、伝播速度をより正確に推定できるようになりました。ポンプレーザーパルスとプローブレーザーパルスの重なりを回避し、干渉する散乱光を最小限に抑えるために、λ = 1064 nm レーザービームをポンプとして適用しました。衝撃波が現れるまでフルエンスを増加させました。アブレーションにより表面が急速に劣化したため、新しい表面を提供するには、連続したアブレーションショットの間にターゲットを移動する必要がありました。さらに、タイミングのジッター、ターゲットの多孔性、およびレーザーパルスエネルギーのわずかな変動はすべて、定量分析におけるある程度の不確実性の原因となります。

図 12 は、この最適化されたセットアップを使用して撮影され、衝撃波形成の初期段階とキャビテーション気泡の外観を捉えた写真を示しています。特定のイメージング方式により、時間の経過とともに、2 つの波面が空間分離を減少させながら伝播しているように見えます。キャビテーション気泡が発生し、成長します。

蒸留水中でのメロキシカムのパルスレーザーアブレーション (λ = 1064 nm、F = 18 J/cm2) の高速写真画像。 (a) – (f) t = 8 ns の時間間隔で 2 つの瞬間に二重露光された波面の形成と伝播。 (c)～(f) キャビテーション気泡の生成と大きさの変化。

ImageJ を使用して、波面の空間分離/距離 (x) が各画像上で測定されました。マイケルソン干渉計は、2 つのプローブパルス間の時間間隔 = 8 ns で導入されました。ポンプパルスの衝撃後の特定の瞬間に、現在の距離を固定時間間隔で割ることにより、プローブパルスで記録された 2 つの瞬間の間の波面の平均伝播速度を計算できます (図 13)。データポイントは、平均伝播速度が水中音速 (vw) を超え、その後、時間の経過とともに減少傾向をたどり、徐々に vw = 1480 m/s に近づいていることを示しています。衝撃波が視野を離れると、200 ns の遅延の後、飽和が約 1550 m/s であると思われる速度データを取得できませんでした (図 13)。ただし、図 10 に示されている波面伝播測定に基づいて、最終的に飽和は vw = 1480 m/s 付近になると想定できます。結論として、最初の衝撃波は、適用されたフルエンスに応じて、数十または数百ナノ秒以内に音波になります。

蒸留水中のメロキシカムのPLAL（λ = 1064 nm、F = 18 J/cm2）によって生成される波面の伝播速度の時間依存性。

溶解度の研究により、適用したすべてのレーザー波長の場合、元のメロキシカム粉末よりもPLAL法で調製した粒子の方が、より多くの量のメロキシカムが緩衝液に溶解できることが示されました（図14）。

市販のメロキシカム (Mx. ref.) およびさまざまなアブレーション波長 (248 nm、532 nm、1064 nm) で作成したサンプルの溶解度データ。

参照メロキシカムの飽和濃度 (0.043 mg/ml) と比較して、248 nm、532 nm、および 1064 nm で PLAL によって生成されたメロキシカム粒子を溶解すると、飽和濃度の 9 倍、4 倍、および 8 倍の増加が測定されました。定量的には、飽和濃度は 0.388 ± 0.0605 mg/ml (λ = 284 nm の場合)、0.163 ± 0.004 mg/ml (λ = 532 nm の場合)、および 0.327 ± 0.026 mg/ml (λ = 1064 nm の場合) となりました。

無毒性限界は、100% の細胞生存率を保証する最高濃度として定義されました。市販薬におけるメロキシカムの治療用量は経口投与量で 7.5 または 15.0 mg であり、肺送達にはこの用量の 1/10 が推奨されています 31,32。したがって、細胞毒性研究の最大濃度として 1 mg/ml 濃度が選択されました。参照メロキシカムは、0.125 mg/ml 未満の濃度では毒性を示さなかった。細胞毒性の測定により、PLAL によって λ = 248 nm および 1064 nm で生成されたサンプルは、0.125 mg/ml 以下では測定可能な細胞毒性効果がないことが示されましたが、一方、λ = 532 nm の場合、無毒性限界は約 0.016 mg/ml でした (図.15）。 PLAL により λ = 248 nm および 1064 nm で生成されたサンプルは、参照メロキシカムと同じ細胞毒性範囲にありましたが、λ = 532 nm で生成された化合物が最も細胞毒性が高かったです。これらの決定された非毒性濃度は、抗炎症測定に使用されました。

調査したアブレーション波長 (248 nm、532 nm、1064 nm) の場合の細胞生存率。

抗炎症効果を試験するために、強力な炎症促進剤である LPS を利用して、A549 細胞の IL-6 産生を増加させました 33。 PLAL で生成された薬物サンプルで処理した後に IL-6 含有量を測定することにより、それらの抗炎症効果を説明し、比較することができました。添加された LPS は、未処理グループと比較して、IL-6 の相対発現を有意に上昇させました。 IL-6 の相対発現は、未処理細胞 (1.1 ± 0.2) と比較して、LPS 処理細胞 (4.2 ± 0.2) の場合には 4 倍になりました。 LPS + 薬物で処理した細胞と LPS のみで処理した細胞における IL-6 の相対発現を比較することにより、UV (λ = 248 nm) と IR ( λ = 1064 nm）レーザーアブレーションによってサンプルが生成され、VIS（λ = 532 nm）レーザーアブレーションサンプルを追加することで大幅な減少（〜75％）が発生しました（図16a）。定量的には、これにより、IL-6 相対発現が UV で 3.1 ± 1.5、VIS で 0.8 ± 0.4、IR で 2.8 ± 1.1 となりました。

(a) 未処理 A549 細胞 (Untreated)、LPS 処理 A549 細胞 (LPS)、LPS で処理した A549 細胞および各波長でのレーザーアブレーションによって生成されたメロキシカム懸濁液 (LPS) の場合の IL-6 の相対発現および (b) 濃度+ 248 nm、LPS + 532 nm、LPS + 1064 nm)。 IL-6 濃度 (b) の場合、LPS および参照メロキシカム懸濁液 (LPS + Mx. ref.) で処理した A549 細胞のデータも示されています。

これらの相対発現レベルがタンパク質レベルと相関するかどうかを決定するために、ELISA測定を実施して上清中のIL-6濃度を測定した(図16b)。未治療グループでは、測定可能な IL-6 レベルはありませんでした。未処理の細胞（0.0 ± 0.0 pg/ml）と比較して、IL-6 濃度は LPS 処理の結果として大幅に増加しました（49.4 ± 7.3 pg/ml まで）。参照メロキシカムを LPS 処理細胞に添加すると、IL-6 濃度は、LPS のみで処理した細胞と比較して 20% (39.9 ± 2.9 pg/ml) 減少しました。 LPS 処理後、レーザーアブレーションしたサンプルを添加すると、IL-6 濃度が 89% (5.6 ± 2.9 pg/ml まで)、95% (2.5 ± 0.4 pg/ml まで)、78% (10.7 ± 2.9 pg/ml まで) 減少しました。それぞれ UV、VIS、IR レーザーを使用して 0.8 pg/ml)。 IL-6 サイトカイン濃度の減少に基づいて、PLAL で生成されたすべてのサンプルは、参照メロキシカムよりもはるかに強力な顕著な抗炎症効果を示しました。測定によれば、細胞毒性測定に基づいて必要な用量が最低であったにもかかわらず、λ = 532 nm で生成されたサンプルは最高の抗炎症特性を示しました。

蒸留水中でのメロキシカムのパルスレーザーアブレーションは、調査した 3 つの波長すべてにおいて効果的で化学薬品を使用しない粒径縮小技術であることが証明されました。

FTIR、ラマン分光法、HPLC-MS 研究により、アブレーション中の化学分解は無視できることが示されました。メロキシカム不純物 B は比較的少量で存在しました。粒子はプロセス全体を通じて結晶性を維持し、その形態は壊れた結晶の形態に似ていました。メロキシカム粒子の初期サイズは約 30 μm でしたが、肺送達に最適な数百ナノメートルから数マイクロメートルの範囲のサイズに縮小することができました。高速写真分析により、機械的破砕が粒子サイズの縮小につながる主なプロセスであることが確認されました。薬学的適用可能性は、それぞれのアブレーション波長におけるアブレーションされたサンプルの溶解度の大幅な (9 倍、4 倍、および 8 倍) 増加によって裏付けられます。 PLAL 生成懸濁液の細胞毒性効果は同等 (λ = 248 および 1064 nm で約 0.125 mg/ml) またはそれ以上 (λ = 532 nm で約 0.016 mg/ml) であるにもかかわらず、抗炎症効果は優れていました (IL-6濃度は、λ = 248、532、1064 nm でそれぞれ 89、95、78% 減少し、参照メロキシカムの濃度を大幅に上回りました。

得られた溶解性、細胞毒性および抗炎症特性に基づいて、PLAL 技術によって細断された粒子を使用することにより、大幅に少ない薬剤用量で同じ治療効果が達成できることが期待されます。

したがって、蒸留水中のパルスレーザーアブレーションによって生成されたメロキシカム粒子は、経口投与または肺投与に適している可能性があります。あるいは、水に懸濁したメロキシカムを固体の中間生成物に変換して、さまざまな剤形（錠剤、カプセル、またはドライパウダー吸入器など）を調製することもできます。

現在の研究中に生成されたデータセット、および/または現在の研究中に分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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この研究は、国家研究開発イノベーション基金の資金源から、イノベーション技術省の ÚNKP-21-3-SZTE-446 New National Excellence Program によって支援されました。プロジェクト番号 TKP2021-EGA-32 は、TKP2021-EGA-32 資金調達スキームに基づいて資金提供された国立研究開発イノベーション基金からのハンガリーイノベーション技術省の支援を受けて実施されました。

セゲド大学が提供するオープンアクセス資金。資金はセゲド大学オープンアクセス基金、助成金番号 5722 によって提供されました。

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ピロスカ・ザボ＝レベス & リタ・アンブルス

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EN はアブレーション実験と FTIR 測定を実施しました。 EN および Zs.H. 迅速な写真測定と計算を担当しました。 TS が技術サポートを提供しました。 JK と EN は、SEM およびラマン調査を実行、分析、視覚化しました。 MN が実行し、MN と TA が HPLC-MS 測定を分析しました。 DK は KB の監督のもと、細胞毒性と抗炎症性の研究を実施し、分析しました。 P.Sz.R. と RA は XRPD と溶解度の測定結果を提供し、論文の薬学的背景を裏付けました。 BH は概念化と監督を提供しました。 EN は主な原稿テキストを書き、図を準備しました。著者全員が原稿のレビューと編集に参加し、最終版の出版を承認しました。

エステル・ナジへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

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受信日: 2022 年 4 月 14 日

受理日: 2022 年 7 月 14 日

公開日: 2022 年 7 月 22 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16728-9

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