重要なタンパク質の分析

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 350 (2023) この記事を引用

2211 アクセス

10 オルトメトリック

メトリクスの詳細

近年、コロナウイルス感染症（COVID-19）の世界的なパンデミックの原因として、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）とその変異種、特に高い感染力と実質的な免疫回避を有するウイルスが出現しました。博士らは、コロナウイルス（CoV）と戦うためのワクチン接種以外の持続可能な解決策として、新しい治療法の開発が不可欠であることを強調している。受容体認識とウイルス侵入に加えて、SARS-CoV-2複製/転写複合体のメンバーは、抗ウイルス薬を設計するための有望な標的である。ここでは、nsp10とnsp16およびnsp14のタンパク質間相互作用（PPI）を媒介する相互作用残基を包括的に分析し、主要な残基の相互作用マップ、相互作用エネルギー、構造ネットワーク、およびダイナミクスを調査した。 Nsp10 は、nsp14 のエキソリボヌクレアーゼ (ExoN) と nsp16 の 2'O-メチルトランスフェラーゼ (2'O-MTase) の両方を刺激します。 Nsp14 ExoN は、複製忠実度をサポートする RNA 校正酵素です。 Nsp16 2'O-MTase は、効率的な複製と翻訳を確保し、宿主細胞の自然免疫系から逃れるための RNA キャッピングの完了に関与しています。 PPI 分析の結果は、SARS-CoV-2 抗ウイルス薬の設計に影響を与える重要な情報を示唆しました。 nsp16-nsp10 および nsp14-nsp10 相互作用の予測された共有タンパク質間界面に基づいて、二重標的ペプチド阻害剤のセットが設計されました。設計されたペプチドは、分子ドッキング、ペプチド-タンパク質相互作用分析、および自由エネルギー計算によって評価され、その後、インシリコ飽和突然変異誘発によってさらに最適化されました。 CoV間で相互作用する標的残基の進化的保存の予測に基づいて、設計されたペプチドは二重標的汎コロナウイルス阻害剤として開発される可能性がある。

2019 年新型ヒトコロナウイルス感染症（COVID-19）は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2（SARS-CoV-2）1 による感染の結果として、世界中で多数の死亡者が確認され、世界的な経済危機を引き起こしています。近年。 SARS-CoV-2 は、RNA ウイルス科コロナウイルス科 2 に属するエンベロープを持った球状ベータコロナウイルスです。 SARS-CoV-2のゲノムは、コウモリコロナウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（SARS-CoV）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）とそれぞれ96.2％、79％、50％の配列同一性を共有している。 SARS-CoV-2 とその変異種、特に懸念される変異種 (VOC) の出現と、2002 年から 2003 年にかけて感染者数 8,096 名、死亡者数 774 名 (致死率約 10%) を記録した SARS-CoV の初期の緊急事態と MERS の出現-2012年の新型コロナウイルス感染症は、感染者1,728人、死亡者624人（致死率約36％）3を記録し、コロナウイルス（CoV）が長い間人類にとって大きな脅威であったことが証明された。特に乳児や小児では、風邪を引き起こす他のヒトの新型コロナウイルスの病原性も考慮する必要があります4。他の CoV に匹敵する SARS-CoV-2 の宿主細胞侵入の加速 5、より高い感染力 (デルタの 3.2 倍) と実質的な免疫回避を備えた Omicron 変異体 (B.1.1.529) の出現 6、および最近のBA.4 や BA.5 などの新興亜系統では、既存のワクチンの有効性が低下し、それによって再感染やワクチン回避が促進されています7。したがって、初期の新型コロナウイルス感染症ワクチンや治療薬は長期にわたる解決策にはなり得ません。したがって、SARS-CoV-28、9、10の診断および監視技術の開発に加えて、持続可能な解決策としてCoVと戦うための新しい治療法を開発することが不可欠です。

オープンリーディングフレーム (ORF) 1a/b は、SARS-CoV-2 ゲノム内で最大の ORF です。これらのORFはゲノムの5'末端に位置し、2つの非常に大きなレプリカーゼポリタンパク質前駆体、pp1aおよびpp1abをコードしており、これらはウイルスプロテアーゼによって翻訳後に切断されて16の非構造タンパク質（nsps）になります11（図S1）。 Nsp12、nsp13、nsp16、nsp14、nsp10、nsp7、および nsp8 は、ウイルスの生存、進化、および増殖に関与する SARS-CoV-2 複製および転写複合体 (RTC) の必須メンバーです。 RTC は、nsp-nsp および nsp-ウイルス RNA 相互作用の複雑な構築を通じて RNA 複製、転写、校正、キャッピングを促進します 11、12、13、14。

すべての真核細胞の核における進化的に保存された共転写プロセスにより、新生 mRNA の 5' 末端が確実にキャップで修飾されます。 mRNA キャップは、エキソヌクレアーゼ切断に対する保存分子群として機能し、RNA 分子を安定化し、効率的な核細胞質輸送、活発なキャップ依存性タンパク質翻訳、およびプレ mRNA プロセシングを確保し、また自然免疫応答における非自己 RNA の区別も防ぎます 15,16 。 RNA のキャッピングは、さまざまなメカニズムを通じて宿主免疫系の応答を克服するためにウイルスによってハイジャックされています。コロナウイルス科のメンバーは、独自の特有のキャッピングプロセスを進化させてきました17。 SARS-CoV-2のキャッピング機構は、RNA 5'トリホスファターゼ（RTPase）としてのnsp13、未知のグアニリルトランスフェラーゼ（GTase）、N7-グアニンメチルトランスフェラーゼとしてのnsp14のC末端を含む一連のnspsによって実行される4つのステップで構成されています。 (N7-MTase) 活性、および 2'O-メチルトランスフェラーゼ (2'O-MTase) 活性に対する nsp16 とその重要な補因子 nsp10 12、18、19 (図 1b)。

SAR-CoV-2 複製・転写複合体 (RTC) とその mRNA キャッピングプロセスの概略図。 (a) SARS-CoV-2 RTC の主要メンバーには、ヘリカーゼおよび RNA 5' トリホスファターゼ活性を持つ多機能タンパク質である RNA 依存性 RNA ポリメラーゼ (RdRp; nsp12) (Hel-RTPase; nsp13)、メチルトランスフェラーゼ酵素 (MTase; nsp16) が含まれます。およびnsp14のC末端）、エキソリボヌクレアーゼ（ExoN; nsp14のN末端）、およびnsp14 ExoNとnsp16 MTaseの両方を活性化するための重要な活性化因子としてのnsp10。 (b) SARS-CoV-2 mRNA キャッピングプロセスのステップ: まず、新生三リン酸化 RNA (pppN) の 5' 末端のリン酸間結合が RTPase としての nsp13 によって加水分解され、二リン酸 5'-ppN 転写末端が形成されます。次に、グアノシン三リン酸 (GTP) は未知のグアニリルトランスフェラーゼ (GTase) によってグアノシン一リン酸 (GMP) に切断され、5'-二リン酸 mRNA に転写されて GpppN が生成されます。第三に、cap-0 構造 (7mGpppN) は、S-アデノシルメチオニン (SAM) の存在下で nsp14 N7-グアニン-メチルトランスフェラーゼ (N7-MTase) によって形成されます。最後に、cap-1 構造は、2'O-メチルトランスフェラーゼ (2'O-MTase) 活性を持つ nsp16-nsp10 複合体によって生成されます。

RTC メンバー、特に nsps のタンパク質間相互作用 (PPI) を研究することは、特にウイルスが宿主細胞に侵入した後の、CoV に対する有望な干渉阻害剤を設計するための生産的な手段となる可能性があります。ほぼすべての生物学的プロセスにおける PPI の重要な役割により、PPI は治療アプローチにとってますます魅力的になっています 20。最近、干渉ペプチド (IP) がより一般的に認識されるようになり 21、PPI を標的とするいくつかの治療用ペプチドが米国食品医薬品局 (FDA) によって承認されました 22。いくつかの研究で、CoV の PPI を阻害する誘導ペプチドの効力が実証されています 23、24、25、26、27。さらに、臨床データとコンピューターによるアプローチは、SARS-CoV-2 nsps ワクチンが、COVID-1928 に対する全体的な免疫を与える能力を備えた免疫優勢ペプチドであると提案しています。

私たちは最近、SARS-CoV-2 侵入のタンパク質間結合パターンを調査しました29。現在の研究の全体的な目的は、SARS-CoV-2 RTC における nsp16 キャッピング MTase および nsp14 ExoN の両方との共通の活性化因子としての nsp10 の相互作用に光を当て、これらの重要な PPI を標的とするペプチド阻害剤を設計することでした (図.S2)。最初に、これらの PPI に関与する重要な相互作用残基が調査され、その後、自由エネルギー分解、相互作用マップとエネルギー、構造ネットワーク、分子動力学の観点から分析されました (図 S3)。これらの包括的な分析により、SARS-CoV-2 のキャッピングおよび校正メカニズムを仲介するために最も重要な重要な残基の全体像が得られます。これらの重要な残基は創薬可能な残基として機能し、SARS-CoV-2 の薬剤設計に影響を及ぼします。次に、得られた結果に従って、nsp16-nsp10 および nsp14-nsp10 相互作用の予測された共有タンパク質間界面に基づいて、二重標的阻害ペプチドのセットが設計されました。したがって、これらのペプチドは、SARS-CoV-2のRNAキャッピングと校正機構を同時に妨害する新たな経路を切り開き、ウイルスが宿主の免疫認識から逃れるのを阻害し、変異率を高め、その結果、SARSに対する致死的な影響をもたらす可能性がある。新型コロナウイルス-2。設計されたペプチドと相互作用した標的残基について、CoVの広範囲にわたって進化的保存が予測されることは、現在または将来起こり得るCoV関連の流行に対する新しい汎コロナウイルス抗ウイルス薬として開発される設計されたペプチドの大きな効力を示している。

Protein Data Bank (rcsb.org/)30 を使用して、SARS-CoV-2 (PDB ID 6W75)31、SARS-CoV (PDB ID 2XYQ)32、MERS-CoV (PDB ID) の nsp16-nsp10 複合構造を取得しました。 5YNB)、および HCoV-OC43 (PDB ID 7NH7)33。 SARS-CoV-2 nsp14-nsp10 複合体構造は、SWISS-MODEL34 を使用して SARS-CoV nsp14-nsp10 複合体 (PDB ID 5C8S)14 をテンプレートとして選択することでモデル化されました。

調査されたタンパク質-タンパク質複合体の界面の残基は、PPCheck 35、欧州バイオインフォマティクス研究所の PISA (タンパク質界面、表面および集合体) サービス (http://www.ebi.ac) を含む 3 つのインシリコツールを使用して予測されました。 .uk/pdbe/prot_int/pistart.html)36、および ISPRED437。次に、KFC2 (Knowledge-based FADE and Contacts)38、DrugScorePPI39、Robetta40 を使用してホットスポット残基を予測しました。結果の精度を向上させるために、ツールを組み合わせてタンパク質間の界面とホットスポットを特定しました。 3 つのツールのうち少なくとも 2 つのツールの結果に残留物が存在する場合、その残留物はキー残留物 (インターフェイスおよび/またはホットスポット) とみなされます。さらに、比較分析のために、SARS-CoV、MERS-CoV、およびHCoV-OC43のnsp16-nsp10複合体のPPI界面とホットスポット残基も上記のアプローチに基づいて予測されました。重要な残基は、UCSF Chimera41 によってタンパク質の構造にマッピングされました。両方の複合体の二次構造プロットは、PDBsum42 を使用して予測されました。次に、SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 および nsp14-nsp10 複合体の予測される重要な相互作用残基の計算アラニンスキャニング (CAS) が、mCSM-PPI2 (http://biosig.unimelb.edu.au/mcsm_ppi2) によって実行されました。 /)、各変異の影響は、野生型と変異型の間のタンパク質間結合親和性の差を予測することによって評価されました。これは、ΔΔGAffinity (ΔΔG = ΔGMutant − ΔGwild-type) として定義されます 43。また、最も負のΔΔGAffinityを有する野生型残基および変異型残基と、それらの近くの残基との間の相互作用を分析した。次に、分子力学一般化ボーン表面積 (MM-GBSA) 計算による残基ごとの自由エネルギー分解分析が、SARS-CoV-2 nsp16- について HawkDock サーバー (cadd.zju.edu.cn/hawkdock)44 によって実行されました。 nsp10 および nsp14-nsp10 複合体。

Ligplot+45 の DIMPLOT を使用して、残基の相互作用を分析し、2D マップに表示しました。また、Protein Interactions Calculator (PIC) サーバー (pic.mbu.iisc.ernet.in)46 を使用して、さまざまな種類の相互作用を分析しました。さらに、COCOMAPS (molnac.unisa.it/BioTools/cocomaps)47 を利用して、距離と特性の接触マップを提供することにより、8 Å のカットオフ距離で調査された PPI 界面を分析しました。さらに、複合体のアクセス可能な表面積は COCOMAPS によって予測されました。さらに、残基間の相互作用エネルギー (IE) は、水のような AMBER parm99 力場 (OBC) の助けを借りて、アミノ酸相互作用 (INTAA) Web サーバー (bioinfo.uochb.cas.cz/INTAA/)48 によって予測されました。 -II) 環境、および水素追加モード。ヒートマップはTHE Heatmapper49を使用して生成されました。 SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 複合体と nsp14-nsp10 複合体の両方に対して手順全体が実行されました。

SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 および nsp14-nsp10 複合体の構造ネットワーク解析には、タンパク質構造ネットワーク解析 (NAPS) サーバー (bioinf.iiit.ac.in/NAPS/index.php)50 が使用されました。ネットワーク内の残基の次数中心性 (DC)、媒介中心性 (BC)、および近接中心性 (CC) を含むノード中心性パラメーターは、上限閾値 7 Å の C-alpha 非重み付けネットワークタイプを選択することによって予測されました。 NAPSのタンパク質複合体モード。

nsp14-nsp10、nsp16-nsp10 複合体、および nsp14、nsp16、および nsp10 タンパク質の分子動力学 (MD) シミュレーションは、ff14SB 力場 52 を使用して AMBER14 パッケージ 51 によって実行されました。この系は、xleap を使用して、12 Å 水和層の切頭八面体ボックス内の明示的な水 TIP3P モデルによって溶媒和されました。系を中和するために 5 つの塩化物イオンを添加しました。水素原子のすべての共有結合は、SHAKE アルゴリズム 53 を使用してシステムに追加されました。静電相互作用は、周期境界条件下でのレナード・ジョーンズ電位相互作用のしきい値 10 Å を使用して、PME (Particle Mesh Ewald) アルゴリズム 54 を使用して計算されました。最小化ステップは、最急降下法の 2000 ステップと共役勾配法の 3000 ステップをそれぞれ使用して高エネルギー接触を除去するために実行されました。次に、各システムを一定体積で 400 ps かけて 0 ～ 300 K まで完全に加熱しました。系の平衡は、一定の圧力および温度条件下で 1 ns 間実行されました。平衡化後、pmemd を使用して 100 ns の期間にわたってシミュレーションが実行されました。シミュレーション内の温度を制御するために、ランジュバンアルゴリズム 55 が使用されました。最後に、cpptraj56 を使用して軌跡を分析しました。 XMGRACE57 を使用して、二乗平均平方根偏差 (RMSD) および二乗平均平方根変動 (RMSF) プロットを生成しました。

この研究では、阻害ペプチドは 2 つの方法論に基づいて設計されました。最初のアプローチでは、SARS-CoV-2 の nsp16 および nsp14 の両方と相互作用する nsp10 の予測された重複相互作用残基に基づいて、阻害ペプチドが手動で設計されました。 2 番目のアプローチでは、SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 および nsp14-nsp10 複合体の界面にある PPI を Peptiderive58 サーバーを使用して個別に分析し、nsp16/nsp14 を標的とするペプチド阻害剤を設計しました。 Peptideriv は、スライディングウィンドウ (各予測段階で 5 ～ 15 の長さ) を使用して nsp10 からペプチドを体系的に分離し、これらの単離されたペプチドの全体的な相互作用への寄与を評価しました。

最初のステップでは、HPEPDOCK サーバー (http://huanglab.phys.hust.edu.cn/hpepdock/)59 を使用して分子ドッキングを実行し、設計されたペプチドとそれぞれのターゲットをローカルにドッキングしました。標的の結合部位残基は、標的の予測された主要な相互作用残基に基づいて参照として特定されました。各ペプチド-ターゲット複合体の上位 10 の予測モデルからの最良のモデル選択基準は次のとおりです: (i) 参照相互作用と比較して同様のポーズでターゲットのキー残基に結合し、より多くのキー残基と相互作用するモデルターゲットの。 (ii) すべての予測モデルの中で相対的に RMSD が低いモデルを参照構造と重ね合わせて調べます。 (iii) ドッキングエネルギースコアが最も低いモデル。ペプチド-タンパク質複合体の各モデルは、DIMPLOT45 および UCSF Chimera41 を使用して解析されました。 HPEPDOCK の結果に基づいて、最良のペプチドに対してさらなるドッキング分析が行われました。次に、選択したペプチドの 3D 構造を MODPEP (http://huanglab.phys.hust.edu.cn/modpep/)60 を使用してモデリングしました。最適なモデルが選択され、このステップに続いて HADDOCK 2.461 を使用してペプチドとタンパク質のドッキングが行われました。前のステップで予測された重要な相互作用残基は、ペプチドとタンパク質の相互作用に直接関与する活性残基として特定され、活性残基の周囲の半径 6.5 Å 以内のすべての周囲表面残基は受動的残基として定義されました。注目すべきは、nsp14 の ExoN ドメインが分子ドッキングに使用されたことです。ここでは、前のステップと同じ最適なモデル選択基準が使用されました。ドッキングの第 2 ステップによって得られた、設計されたペプチド - ターゲットの最良の複合体の結合自由エネルギー (ΔG) と解離定数 (Kd) は、Prodigy (wenmr.science.uu.nl/prodigy) を使用して予測されました62。さらに、ff02 力場、2000 サイクルの最急降下、および HawkDock (cadd.zju.edu.cn/hawkDock)44 での 3000 サイクルの共役勾配最小化を使用した MM-GBSA 計算を使用して、ペプチドの結合自由エネルギーを計算しました。 –タンパク質複合体を分析し、それらを残基ごとの寄与に分解します。

MM-PBSA63 法を使用して、最高スコアの設計されたペプチドのそれぞれの標的に対する結合自由エネルギー (ΔGbinding) を推定しました。 50 ns の間、最高スコアのペプチド - タンパク質複合体の MD シミュレーションが AMBER1451 を使用して実行されました。次に、さまざまなタイムステップでの軌跡からペプチド - タンパク質複合体の 200 個のスナップショットを取得し、mmpbsa.py64 による ΔGbinding の平均値を計算しました。

最高スコアの設計ペプチドは、インシリコ飽和突然変異誘発解析を使用して、設計ペプチドの各残基をリード配列として他の 19 アミノ酸に変異させ、新しいペプチドライブラリを生成することにより最適化されました。次に、リードペプチド-ターゲット複合体に対する新しい変異体ペプチド-ターゲットの結合親和性の変化(ΔΔGAffinity)、およびペプチド-ターゲット結合親和性に対する各変異の影響を、mCSM-PPI243を使用して予測しました。設計したペプチドをさらに評価するために、分子量、等電点、pH 7 での正味電荷などの一般特性を Pep-CaLc65 を使用して計算しました。また、設計されたペプチドの薬物動態学的特性は、pkCSM (http://biosig.unimelb.edu.au/pkcsm/) によって予測されました66。設計されたペプチドの半最大阻害濃度 (IC50) は、ランダムフォレスト (RFs) 機械学習技術を使用した AVP-IC50Pred (crdd.osdd.net/servers/ic50avp/) によって予測されました 67。ペプチドのアレルゲン性と毒性は、それぞれ AllergenFP v.1.068 と ToxinPred69 によって予測されました。標的タンパク質-ペプチド複合体は、CABS-flex 2.0 (biocomp.chem.uw.edu.pl/CABSflex2/index)70 を使用してシミュレーションされ、残基の変動を分析し、RMSF プロットを生成するデフォルトのパラメーターが使用されました。

SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-229Eを含む7つのヒトCoVのnsp10、nsp16、およびnsp14配列の複数の配列アラインメントが実施されました。 MultAlin71を使用します。 ESPrip はシーケンスのレンダリングに使用されました 72。 SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-OC43 を含む、報告されている nsp16-nsp10 複合体のすべての構造における nsp10 および nsp16 タンパク質の進化的に保存された残基を調査するには、ConSurf Web サーバー (consurf)ベイジアン法に基づいてτac.il/)73を採用した。さらに、SARS-CoV-2 nsp14 タンパク質モデルのアミノ酸保存が分析されました。

この研究では、まず、PPIを媒介するタンパク質間複合体の界面にある重要な残基を予測した。この研究のワークフローを図 S3 に示します。 SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 および nsp14-nsp10 複合体の最終予測タンパク質間界面およびホットスポット残基を表 1 に示します。各ツールを使用して予測された主要な相互作用残基を表 S1 に示します。 nsp16-nsp10複合体については、33残基がnsp16界面残基として予測され、26残基がnsp10界面残基として予測された。 nsp10 の V42、K43、M44、L45、および Y96、および nsp16 の I40、M41、V44、T48、V78、V84、Q87、V104、および D106 は、nsp16-nsp10 複合体のホットスポット残基として予測されました。 nsp14-nsp10複合体では、タンパク質間界面で106残基、nsp14とnsp10の界面でそれぞれ45残基と61残基が同定された。 T5、E6、N10、S11、L14、S15、F16、F19、V21、N40、V42、M44、S72、R78、C79、H80、F89、K93、および Y96 は、nsp14-nsp10 複合体の nsp10 ホットスポットとして予測されました。両方の複合体の重要な相互作用残基は、それらの構造にマッピングされました（図2a、b）。また、SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 および nsp14-nsp10 複合体の二次構造プロットをそれぞれ図 S4 および S5 に示します。

SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 および nsp14-nsp10 のタンパク質間界面とホットスポット残基の分析。（ a ）界面とホットスポットは、nsp16（灰色）とnsp10（シアン）のタンパク質間界面のnsp16-nsp10構造にマッピングされており、それぞれオレンジ色と赤色で色付けされています。 (b) nsp14 (マゼンタ) と nsp10 (シアン) のタンパク質間界面の界面とホットスポットは、それぞれ黄色と赤色で色付けされています。ホットスポット残基は赤いラベルで示されます。 (c) nsp16 および nsp14 タンパク質の両方と相互作用する、nsp10 (シアン) の重なり合うキーインターフェイス (紫) およびホットスポット (赤) 残基。

注目すべきことに、nsp10の重要な相互作用残基のうち、24個のインターフェース残基と3個のホットスポット残基がSAR-CoV-2の2つの複合体間で共有されていた。 nsp10 のこれらの重要な残基は、nsp16 (2'O-MTase キャッピング) および nsp14 (ExoN 校正) の両方と相互作用しました。これら 2 つの複合体における nsp10 の重複する共通界面残基は、T39、N40、C41、V42、K43、M44、L45、C46、T47、V57、T58、P59、G69、G70、A71、S72、C77、R78、C79、 H80、K93、G94、K95、Y96。一般的なホットスポットは V42、M44、Y96 でした (図 2c)。さらに、PPI の界面残基とホットスポット残基の分析により、nsp10 および nsp14 ExoN ドメインの N 末端ループと H1 ヘリックスの残基間の相互作用が示されました。さらに、CoV 間の nsp10 と nsp16 の相互作用の類似点と相違点を解明するために、SARS-CoV、MERS-CoV、および HCoV-OC43 における nsp16-nsp10 複合体のタンパク質間界面およびホットスポットも、同じアプローチです (表 S1)。 V42、K43、M44、L45などの残基は、これらすべてのCoVでnsp10の共通のホットスポットでした。違いは、SARS-CoVのnsp10のT47、R78、およびY96にありました。 MERS-CoVにおけるnsp10のK58、H80、およびF96。 HCoV-OC43 における nsp10 の N40、C41、C46、D47、V57、K58、S72、C77、R78、H80、L89、C90、R93、K95、および F96。 V84、Q87、V104、およびD106は、これらのCoVの間でnsp16の共有ホットスポットでした（図S6-S8）。

次に、予測された主要な相互作用残基を、mCSM-PPI2 を使用した CAS によって分析しました。タンパク質間結合の親和性に対するアラニン置換の影響を予測するために、合計 153 の変異が分析されました (表 S2)。図S9に示すように、変異はそれぞれnsp10のY96A、L45A、V42A、M44A、およびG70Aを含む。 nsp16-nsp10複合体におけるnsp16のV84A、D106A、V44A、I40A、およびR86A。 nsp14-nsp10複合体におけるnsp10のF16A、Y96A、H80A、E6A、およびF19A、ならびにnsp14のF8A、P24A、F60A、Q22A、およびD10A。は最も負のΔΔGAffinityを示し、nsp16-nsp10およびnsp14-nsp10結合親和性に対する影響が最も大きく減少しました。これらの結果は、PPI の媒介におけるこれらの残基の重要な役割を明らかにしました。 nsp10 の G70、nsp16 の R86、および nsp14 の P24 を除くこれらの残基はすべて、前のステップでホットスポットとして予測されました。ただし、nsp16-nsp10複合体におけるnsp10のT49A、V57A、およびC79A、nsp16のT91A、G92A、およびS248A、nsp10のP8A、S33A、V57A、およびC79A、およびnsp14のT21A、C39A、およびK47Aを含む変異は、 nsp14-nsp10 複合体では、小さな正の ΔΔGAffinity 値 (< 1.3 kcal/mol) を示し、複合体形成にとってそのような残基の重要性が最も低いことを示しています。最も負のΔΔGAffinityを有する野生型残基と変異型残基とそれらの近くの残基との間の相互作用を図1〜3に示す。 S10 ～ S13。さらに、nsp16-nsp10およびnsp14-nsp10複合体に対するMM-GBSA法を用いた残基ごとの自由エネルギー分解分析の結果を表S3に示します。これらの結果は、重要な相互作用残基が他の残基と比較して PPI の結合自由エネルギーに大きく寄与していることを示しました。 nsp16-nsp10複合体におけるnsp10のL45、V42、およびM44、ならびにnsp16のQ87、I40、およびV104の最も低い推定結合自由エネルギー。 nsp14-nsp10複合体におけるnsp10のF19、V21、およびH80、ならびにnsp14のN130、H26、およびI201は、それぞれこれら2つのPPIにおいて最大の寄与を示した。 MM-GBSA の結果は、ホットスポット予測および CAS の結果と一致しました。ただし、nsp14 の N130 は、前のステップではホットスポットとして予測されませんでした。

SARS-CoV-2 nsp16-nsp10複合体における残基間相互作用の2Dマップの分析によると、疎水性相互作用が最も豊富な相互作用でした（図S14a）。 nsp10 の N40、V42、K43、M44、L45、P59、A71、K93、および Y96 は、nsp16 残基とのいくつかの疎水性相互作用に寄与しました。さらに、nsp10 の K43、L45、A71、K93、G94、および Y96 は、nsp16 の残基と H 結合を形成しました。 nsp10 の A71 および G94 は、nsp16 の D106 との水素結合に参加しました。さらに、nsp10 の K43、L45、K93、および Y96 は、それぞれ nsp16 の K38、Q87、S105、および A83 と H 結合を形成しました。 PIC による nsp16-nsp10 相互作用の分析では、DIMPLOT と同じ結果が得られ (表 S4)、疎水性相互作用が優勢であることが示されました。さらに、PIC分析により、nsp10のE66およびH80が、それぞれnsp16のK38およびD102とイオン相互作用を形成していることが示された。また、比較分析を行うために、他の CoV (SARS-CoV、MERS-CoV、および HCoV-OC43) における nsp16-nsp10 複合体の残基相互作用の 2D マッププロットを生成しました。その結果を図 2 および図 3 に示します。 S15～S17。

SARS-CoV-2 nsp14-nsp10複合体のDIMPLOT結果によると（図S14b）、残基の相互作用は、nsp16-nsp10複合体で観察されたものと同様に、タンパク質-タンパク質界面で主に疎水性でした。水素結合分析により、nsp10 の K43 および L45 が nsp14 の C39 と水素結合を形成していることが明らかになりました。他の水素結合は、nsp10 の T5、E6、および S15 と、nsp14 の S28、T5、および F60 の間にそれぞれ見つかりました。 nsp10 の K93 は、2 つの H 結合を介して nsp14 の D126 および T127 との相互作用に寄与しました。また、nsp10 の N40、G94、Y96 と nsp14 の H29、K47、D41 の間にそれぞれ水素結合が形成されました。同様に、DIMPLOT と PIC の結果は、nsp14-nsp10 複合体についても同じでした。さらに、他の異なるタイプの相互作用、つまりイオン、芳香族-硫黄、芳香族-芳香族、およびカチオン-πの相互作用が、nsp14-nsp10複合体についてPICによって予測されました(表S4)。 SARS-CoV-2 nsp10 と nsp16 および nsp14 との相互作用の違いは、主に nsp10 の N 末端の残基と nsp14 の相互作用にあり、A1、A18、F19、V21、およびそれぞれ、nsp10 の D29、および nsp14 の K9、K196、I201、I201、および Y69。さらに、nsp10 の N3 は、nsp14 の D10 と 2 つの H 結合を形成しました。

カットオフ距離 8 Å の分子間接触を COCOMAPS を使用して分析し、SARS-CoV-2 nsp10 と接触している nsp16/nsp14 領域を表しました。距離範囲の接触マップ（図S18a）では、両方の複合体の分子間接触が距離の増加に応じて色付けされています。 Y96-A83、K43-K38、K93-S105、L45-Q87、および G94-D106 を含む nsp10 および nsp16 の残基ペアは、< 2.82 Å の最小距離を示しました。さらに、nsp14 および nsp10 の F60-S15、K9-A1、および Y69-D29 を含む残基ペアが、nsp14-nsp10 複合体で < 2.64 Å の最小距離で観察されました。 nsp14-nsp10複合体の接触マップは、N末端のnsp14 ExoNの活性化におけるnsp10相互作用残基の役割を示している可能性がある。 nsp10とnsp14のC末端との間に分子間接触は観察されなかった。相互作用の物理化学的性質は、特性接触マップによって示されます（図S18b）。特性マップで明らかにされているように、両方の複合体では疎水性相互作用が親水性相互作用よりも大きく寄与しています。これらの結果は、DIMPLOT および PIC の結果とよく一致しました。さらに、COCOMAPS は、SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 複合体の形成時に約 1852.3 Å2 の大きな領域が埋められ、その大きな界面領域が約 926.75 Å2 であることを示しました。同様に、複合体形成時の SARS-CoV-2 nsp14-nsp10 の埋没面積と界面面積は両方とも大きく、それぞれ 4358.47 Å2 と 2180.15 Å2 でした。

次に、INTAA を使用して、SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 および nsp14-nsp10 複合体の残基間相互作用エネルギー (IE) を分析しました。結果によると、nsp10 の D106 と nsp16 の D125 が最も負の正味 IE を示しました (それぞれ、-190.6 および -518.33 kJ/mol)。予測された主要な相互作用残基の中で、nsp10 の E66、Y96、および S72、ならびに nsp16 の D106、D108、および S105 は、最もネガティブなネット IE を示しました。図S19は、nsp10とnsp16の予測された重要な相互作用残基間の残基-残基ペアワイズIEのヒートマップを示しています。 PPI で安定化の役割を持つ最もネガティブなペアワイズ IE には、それぞれ nsp10 と nsp16 の K93 と D106、K93 と S105、A71 と D106、G94 と D106 の間の相互作用が含まれていました。前述したように、K93 と S105、および G94 と D106 を含む残基のペアの距離は、前のステップで COCOMAPS によって最小距離の中で予測されました。 nsp14-nsp10複合体のIE分析により、nsp10のE6およびnsp14のE284が最も負の正味IEを示すことが明らかになった（それぞれ、-504.75および-296.05 kJ/mol）。 nsp10 の E6、D29、K25、および D22、および nsp14 の D10、D126、E2、および F60 は、nsp14-nsp10 複合体で予測される主要な相互作用残基の中で最もネガティブなネット IE を示しました。 nsp10およびnsp14のD29とY69、S15とF60、F19とK200、E6とV4の間の相互作用は、それぞれ最も安定化するペアワイズIEでした（図S20）。 PPI で最も安定化する役割を持つこれらすべての残基は、前述のステップで重要な相互作用残基として予測されました。

SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 および nsp14-nsp10 複合体のタンパク質接触ネットワーク (PCN) 解析は、タンパク質間ネットワークのノードとしての各残基のトポロジー的重要性を決定するために実行されました。ネットワーク内の残基の次数中心性 (DC)、媒介中心性 (BC)、および近さ中心性 (CC) を含む残基のノード中心性パラメーターは、両方の複合体について予測されました (表 S5)。 nsp16-nsp10 複合体では、nsp10 の G69、G70、Y96、A71、および K95、および nsp16 の V44、A45、V84、および D106 が、予測されたキー残基の中で最も高い DC を示しました。その結果、nsp10 の G69、M44、G70、G94、および K95、および nsp16 の V44、D106、D108、T91、および I40 が、重要な PPI 残基の中で最も高い BC を示すことが明らかになりました。主要な残基の高い CC 値は、nsp10 の M44、G69、V57、K43、および G94、および nsp16 の V44、D106、V84、および A107 について予測されました (図 S21)。 nsp14-nsp10相互作用の予測される重要な相互作用残基のPCN分析により、重要な相互作用残基のうち、nsp10のG70、Y96、A71、K95、およびA20、およびnsp14のK9、D10、I55、およびT131が高いDCを示すことが示された。特に、G70、A71、K95、および Y96 も nsp16-nsp10 複合体で高い DC を有すると予測され、これらのネットワークが両方の複合体で共通であることが示されました。さらに、nsp10 の F19、S15、A20、A18、および V21、および nsp14 の G59、F60、および Y69 は、主要な残基の中で最も高い CC を示しました。主要な残基の高い BC 値は、nsp10 の T5、A18、C79、A20、および F19、および nsp14 の G6、T25、G59、Y69、および F60 で予測されました (図 S22)。 nsp16-nsp10およびnsp14-nsp10複合体の3Dネットワークとそれらの強調表示されたインターフェイスを図S23に示します。

タンパク質の安定性、残基の変動、および動的挙動を調査するために、SARS-CoV-2 のキャッピングおよび校正コンポーネントの 100 ns MD シミュレーションが分析されました。シミュレーション中の構造安定性の基準の 1 つとして、バックボーンの RMSD が参照構造と比較して計算されました。図3aに示されているように、構造のRMSDは最初に上昇し、最初の45ナノ秒の間に増加し、その後は安定したままでした。これらの結果は、構造変化がわずかであり、nsp14 と nsp10 の結合が安定していることを示しました。 Nsp14 は nsp10 よりも大きな RMSD 値を示し、フリーフォームではより柔軟であることを示しています。残基の変動を分析するために、Cα 原子の RMSF を計算しました。 nsp10のRMSFのより高い値は、主にN末端ループ（A1〜V7）、H1ヘリックス（S11〜F19）、およびコイルおよびストランド領域（V42〜T47）で観察されました（図3b）。 nsp10 における H1 ヘリックスのより高い変動は、nsp14 ExoN 活性化における H1 ヘリックスの役割の指標と考えられる可能性があります。 nsp14 の構造では、nsp10 との相互作用を媒介する領域は、タンパク質の N 末端ドメインに位置し、より多くの変動を示しました。 MD シミュレーションにより、nsp14 の 2 つの特定のドメインがヒンジ領域を介して接続されていることが示されました。このヒンジ領域は、nsp14 の ExoN 活性と N7-MTas 活性を分離している可能性があります。バックボーンのRMSDは、nsp16-nsp10複合体の参照構造およびnsp16およびnsp10タンパク質の遊離型に関して計算されました（図3a）。 RMSD 値は 30 ns 後も比較的安定していました。 nsp16-nsp10、nsp16、および nsp10 の平均 RMSD 値は、それぞれ 3.6、2.4、および 2.05 Å でした。次に、nsp16-nsp10複合体、nsp16、およびnsp10タンパク質のRMSF値を計算しました（図3b）。

100 ns の MD シミュレーション中の SARS-CoV-2 nsp14-nsp10 および nsp16-nsp10 複合体の RMSD および RMSF プロット。 (a) nsp14-nsp10、nsp14、nsp10、nsp16-nsp10、および nsp16 の RMSD プロット、および (b) nsp10、nsp14、nsp14-nsp10、nsp16、および nsp16-nsp10 の RMSF プロット。

PPI 分析の結果は、医薬品設計の適切な状況を確立します。前述の分析の結果により、調査した相互作用を標的にして SARS-CoV-2 のキャッピングおよび校正メカニズムを破壊することにより、ペプチド阻害剤を設計することが促されました。この目的のために、最初のアプローチでは、nsp16-nsp10およびnsp14-nsp10相互作用の予測された共有タンパク質間界面（図2c）を考慮して、SARS-CoV-2 nsp16 2'O-MTaseの両方を標的とする阻害ペプチドおよび nsp14 ExoN は手動で設計されました。二重標的ペプチド阻害剤のセット（19ペプチド）（以下、長さが4〜8の範囲の重複ペプチド（OLP）と呼ばれる）（表S6）は、SAR-CoV-におけるnsp10の重複する重要な相互作用残基の予測に基づいて設計されました。 2、すなわち T39 ～ T47、G69 ～ S72、C77 ～ H80、および K93 ～ Y96。一方、並行アプローチでは、Peptiderive サーバーを使用して、有意な結合エネルギーを持つホットセグメントとしての 4 セットのペプチドが複合体ごとに個別に予測されました。合計で、相対界面スコア (パーセント) が最も高い 22 個の直鎖状ペプチド (P-16-5 ～ P-16-15 および P-14-5 ～ P-14-15) (表 S7) と 16 個の環状ペプチド (表 S8) ）をデザインしました。 2 つの方法論によって設計されたペプチドを比較すると、5 つの類似したペプチド配列が明らかになったのは注目に値します。 OLP-11、OLP-13、OLP-16、OLP-18、OLP-19 などの OLP、および nsp16 を標的とするように Peptideriv が設計したペプチド (P-16-5、P-16-6、P-16-5、P-16-6、P-16) 16-7、P-16-8、および P-16-9 は同じ配列です。重要なのは、この研究では直鎖状ペプチドのみが考慮され、さらに評価されたことです。予測される環状ペプチドを評価するには、別の調査研究が必要です。

分子ドッキングを使用して、設計された阻害ペプチドと標的タンパク質との結合姿勢および結合エネルギーを調査した。ドッキング手順には 2 つのステップが含まれます。最初のステップでは、ローカルドッキングアルゴリズムを使用し、ターゲットの主要な相互作用残基を指定することにより、HPEPDOCK によってペプチドとタンパク質のドッキングが実行されました。最良のモデル選択基準に基づいて、設計された 36 個のペプチドのドッキングエネルギースコアは、nsp16 および nsp14 とのドッキングの場合、それぞれ - 152.081 ～ - 49.141、および -226.821 ～ - 67.438 の範囲でした (表 S6 および S7)。 OLP の中で、ターゲットが nsp16 の場合の OLP-13、およびターゲットが nsp14 の場合の OLP-18 が最も低いドッキングエネルギースコアを示しました (それぞれ、-148.518 および -135.334)。両方のターゲットのドッキングエネルギースコアが最も低い OLP が選択されました。ドッキングの第 2 ステップでは、OLP-13、OLP-16、OLP-17、OLP-18、P-16-11、P-16-12、 P-16-13、P-16-14、P-16-15、P-14-11、P-14-12、P-14-13、P-14-14、および P-14-15 が選択されました。

HADDOCK スコア、全体の最低エネルギー構造からの RMSD、ファンデルワールスエネルギー、静電エネルギー、脱溶媒和エネルギー、および各ペプチド - ターゲット複合体の埋没表面積を含む、HADDOCK によるペプチド - タンパク質のドッキングの結果は、以下に報告されています。表S9。研究されたすべてのペプチドは、nsp10 が相互作用するのとほぼ同じ姿勢で nsp16 と相互作用しました。 OLP-nsp16相互作用の中で、OLP-18およびOLP-13は、それぞれ-65.8±4.6および-50±2.1という最も低いHADDOCKスコアを示し、埋め込み表面積はそれぞれ1213.3±29.8および950±16.9Å2であった。 P-16-11 および P-16-13 は、nsp16 を標的とするように特別に設計されたペプチドの中で最もマイナスの HADDOCK スコアを示しました。 OLP-nsp14 相互作用の中で、OLP-18 および OLP-13 は最も低い HADDOCK スコアを示しました (それぞれ、-41.1 ± 1.9 および - 39.1 ± 11.3)。 P-14-15-nsp14 複合体については、最低の HADDOCK スコア (-99.4 ± 2.5) と最大の埋没表面積 (1918.3 ± 24.4 Å2) が予測されました。 nsp16 および nsp14 とドッキングした nsp10 の HADDOCK スコアは、参照として予測されました (それぞれ、-117.1 ± 2 および -123.4 ± 3)。

次のステップでは、最良のペプチド-ターゲット複合体モデルの ΔG および Kd が各ペプチドについて計算されました (表 S9)。各複合体のΔGを参照構造のΔGと比較しました。 SARS-CoV-2 nsp16-nsp10 の ΔG と Kd の予測値は、それぞれ - 12.8 kcal/mol と 4.3 × 10-10 M でした。 nsp16、P-16-15、P-16-14、P-16-12、OLP-18、および P-16-13 をそれぞれ標的とするように設計されたペプチドの中で、最も低い ΔG 値を示しました（最も負の、最高の親和性)。 nsp14 の ΔG および Kd の予測値は、それぞれ -21.6 kcal/mol および 1.4 × 10-16 M でした。 nsp14を標的とするように設計されたペプチド、すなわち、それぞれP-14-15、P-14-14、P-14-13、P-14-12、およびP-14-11は、最も負のΔG値を示した。 nsp14 との相互作用における OLP-13 と OLP-18 の ΔG 値は同じでした (-8.9 kcal/mol)。より低い Kd 値をもつ設計されたペプチドは、それぞれのタンパク質標的により強く結合する可能性がありました。さらに、表S9は、ペプチド-ターゲット複合体のMM-GBSA自由エネルギー分解分析の結果を示しています。 OLP-18、P-16-12、および P-16-13 を含む nsp16 の阻害ペプチド、ならびに P-14-15、P-14-14、および P-14-12 を含む nsp14 のペプチド阻害剤、は、それぞれ最も負の MM-GBSA 自由エネルギーを示しました。設計されたペプチドの残基ごとのエネルギー寄与を表 S9 に示します。残基の結合エネルギーが低いということは、その残基がペプチドと標的の相互作用において重要な役割を果たしていることを示しています。 OLP-13-nsp16、OLP-13-nsp14、OLP-18-nsp16、およびOLP-16-nsp14では、5位のメチオニンがペプチドの他の残基と比較して最も低いエネルギーを示しました。また、エネルギーが最も低い標的タンパク質の上位 10 残基を表 S9 に報告し、上位 5 残基を図 12 および図 15 に示します。 S24～S27。 OLP と nsp16 の相互作用では、I40、M247、V44、および A83 が nsp16 の共通残基であり、エネルギー寄与が最も低く、その結果、より重要な役割を果たしました。 nsp14 の T25、P24、および F8 は、すべての OLP-nsp14 相互作用において共通の重要な残基 (エネルギーが最も低い) でした (表 S9)。表 2 は、設計された阻害ペプチド、それらの予測ドッキングスコア、および結合エネルギーをまとめたものです。

設計されたペプチドのドッキングおよび結合エネルギー分析に続いて、表 2 の設計されたペプチドと標的タンパク質との相互作用が分析され、主要な相互作用残基とその相互作用タイプについてのより良い洞察が得られました。各ペプチドと標的の相互作用に関与する界面の標的タンパク質の残基を表 S9 に示します。 I40、M41、V44、T48、V78、A79、P80、A83、V84、Q87、V104、S105、D106、L244、および M247 を含む nsp16 の残基は、すべての OLP と nsp16 の相互作用に関与する共通の残基でした。。 P-16-11、P-16-12、P-16-13、P-16-14、P-16-15の場合、K38、G39、I40、V44、G77、V78、A79、A83、V84、 nsp16 の Q87、V104、S105、D106、L244、および M247 は、ペプチド -nsp16 複合体の界面にある共通の残基でした。すべての OLP と nsp14 の相互作用における nsp14 の共通の相互作用残基は、F8、A23、Q22、P24、T25、D126、T127、および T131 でした。また、nsp14 の V4、L7、F8、P20、T21、A23、P24、T25、H26、C39、V40、D41、F60、K61、M62、N63、Y64、および I201 は、P-14 の相互作用を媒介するのに共通でした。 nsp14 を使用した -11、P-14-12、P14-13、P14-14、および P-14-15。

OLP-13およびOLP-18とその標的（nsp16およびnsp14）との相互作用マップは、疎水性相互作用がこれらのOLP-標的複合体において最も豊富な相互作用であることを示した（図4）。 OLP-13 の N1 は、nsp16 の A79、D106、および V104 との 3 つの H 結合に参加しました。さらに、OLP-13 の M5 は nsp16 の Q87 と H 結合を形成しました。 OLP-13 の N1 は、nsp14 の T5 および N3 と 2 つの H 結合を形成しました。また、OLP-13 の C2 は、nsp14 の G6 および L7 との 2 つの H 結合に参加しました。他の水素結合は、OLP-13のK4とL6、およびnsp14のT25とD126の間にそれぞれ見出されました（図4a）。 OLP-18 の N1 は、nsp16 の A79、G77、および V104 と 3 つの H 結合を形成しました。 OLP-18 の C2 および K4 は、nsp16 の D106 との水素結合に参加しました。 OLP-18のK4、M5、C7、およびT8は、それぞれnsp16のA83、Q87、L244、およびK38とH結合を形成した。 OLP-18-nsp14の相互作用において、K4はnsp14のD126およびP24と2つのH結合を形成した。 T8およびC2は、それぞれnsp14のK61およびP20との水素結合にドナーとして関与していた（図4b）。他のペプチドの相互作用マップを図2および3に示します。 S28 ～ S31。これらのペプチド-タンパク質複合体では疎水性相互作用が優勢でした。さらに、シミュレーション中の各ターゲットタンパク質-ペプチド複合体の残基の変動を図S32に示します。

OLP-13 および OLP-18 ペプチドとその標的 (nsp16 および nsp14) のペプチド-タンパク質相互作用のマップ。（a）標的タンパク質としてのnsp16（左）およびnsp14（右）とOLP-13のペプチド-タンパク質相互作用。（b）標的タンパク質としてのnsp16（左）およびnsp14（右）とOLP-18のペプチド-タンパク質相互作用。黒い破線とスポークのある茶色の円弧は、それぞれ水素結合と疎水性接触を表します。

設計されたペプチドのうち、最もマイナスの HADDOCK スコアを持つ OLP-13、OLP-18、P-16-11、P-16-13、P-14-14、および P-14-15 をさらなる分析のために選択しました。 (図5)。これらの最もスコアの高いペプチドは、結合自由エネルギーを調査し、最も有望なペプチドを選択するために、MM-PBSA 法を使用した 50 ns MD シミュレーション後のさらなる評価に供されました。 MM-PBSA の結果を表 3 に示します。分析したすべてのペプチドに対する MM-PBSA からのΔGbinding の負の値は、それぞれの標的に対するそれらの好ましい結合親和性を示しました。 P-16-11およびP-14-14は、nsp16およびnsp14について最も低いΔG結合値を示しました（それぞれ、-30.4218および-33.6353 kcal/mol）。 OLP-13とOLP-18は両方ともより良好な結合親和性を示し、nsp14（-17.3694および-19.6176kcal/mol）よりもnsp16（-22.4568および-24.1671kcal/mol）に対するより好ましいΔG結合を示した。

標的タンパク質 (nsp16 および nsp14) に対して最もスコアの高い設計されたペプチドの 3D 構造表示。重要な相互作用残基とペプチドは、それぞれ赤と青緑色で色付けされています。

分子ドッキングとその後の MM-PBSA による結合自由エネルギー解析の 2 つのステップを経て、最もスコアの高い 6 つのペプチド (図 5) が包括的なインシリコ飽和突然変異誘発解析用のリードペプチド配列として選択され、結合親和性が向上したペプチドが同定されました。設計されたペプチドと標的の結合親和性に対する各変異の影響を調査します。これに関して、6つのリード配列の各残基を他の19アミノ酸に変異させることにより、1539個の新しいペプチド配列を含むペプチド阻害剤の大規模なライブラリーが生成されました（表S10）。野生型と比較して変異体のΔΔGAffinityが正であることは、ペプチド-標的親和性に対するこの変異の影響が改善されたことを示した。 OLP-13 および OLP-18 では、それぞれ 17.5% および 34.8% の置換が正の ΔΔGAffinity を示し、ペプチド-nsp16 相互作用への影響が改善されました。しかし、0.06% と 0.07% のみがかなりの ΔΔGAffinity (> 0.5 kcal/mol) を示しました。 OLP-13-nsp14 および OLP-18-nsp14 の相互作用では、変異の 15% と 40% がそれぞれ正の ΔΔGAffinity による影響の改善を示しました。ペプチド残基のフェニルアラニン、トリプトファン、チロシンへの変異は、ペプチドと標的の親和性に対するこれらの変異の改善効果が最も高く、最も正のΔΔGAffinity (青色) を示しました。ただし、これらのアミノ酸は、nsp16との相互作用におけるOLP-13のN1、K4、およびM5、またはOLP-18のK4およびM5での置換など、いくつかの位置で予測された結合親和性を減少させました（図6a）。 nsp14と複合体を形成しているOLP-13のC2およびK4を他の19アミノ酸すべてに変異させると、影響が減少しながら負のΔΔGAffinity（赤色）が生じ、OLP-13-nsp14相互作用におけるこれらの残基の重要な役割が実証されました（図6b））。他のリードペプチドのインシリコ飽和突然変異誘発を表すヒートマップを図S33に示します。さらに、最適化された阻害ペプチドを得るために、設計されたペプチドの物理化学的、薬物動態学的、および毒性特性が予測されました。これらのプロパティの詳細を表 S11 に示します。アレルゲン性予測により、設計されたペプチドがアレルゲンの可能性が高いものとアレルゲンではない可能性が高いものとして分類されました。さらに、毒性分析により、P-16-11、P-16-12、および P-16-13 を除くすべての設計ペプチドが非毒性として分類されました。

OLP-13 および OLP-18 阻害ペプチドの in silico 飽和突然変異誘発解析を表すヒートマップ。 (a) OLP-13-nsp16 と OLP-18-nsp16 の相互作用、および (b) OLP-13-nsp14 と OLP-18-nsp14 の相互作用。ペプチドと標的の結合親和性に対する影響を改善する (正の ΔΔGAffinity) および減少する (負の ΔΔGAffinity) 影響を持つ変異は、それぞれ青と赤で示されます。

パンコロナウイルスペプチド阻害剤を同定するために、設計されたペプチドと相互作用することが確認された標的残基の保存性がCoV間で分析された。 7つのヒトCoV、すなわちSARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-229Eに由来するnsp16の多重配列アラインメント分析により、次のことが明らかになった（図S34a）。ペプチドと相互作用するG39、A79、P80、V84、V104、S105、およびD106を含むnsp16の残基は、これらのCoVで同一であった。 nsp16のI40、M41、T48、G77、V78、A83、Q87、L244、およびM247は同様の残基であった。 HCoV-OC43 と HCoV-HKU1 nsp16 の両方では I40 がシステインに置き換えられ、MERS-CoV nsp16 ではバリンに置き換えられました。 MERS-CoVのnsp16では、M41、T48、V78、M247がそれぞれヒスチジン、メチオニン、イソロイシン、ロイシンに置換された。 HCoV-HKU1 では、G77 がグルタミン酸に置き換えられています。 MERS-CoVではA83がセリンに、HCoV-NL63ではスレオニンに置き換えられました。 HCoV-NL63 および HCoV-229E の nsp16 では、L244 および M247 がそれぞれバリンおよびロイシンに置換されました。次に、4つのCoV（SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、およびHCoV-OC43）間のnsp16-nsp10複合体の保存を分析しました（表S12）。 nsp16 の G39、T48、V84、S105、および D106 は、保存スコア 9 (濃いマゼンタ) で最も高度に保存された残基でした。 I40、M41、V44、G77、V78、A79、P80、Q87、V104、および L244 を含む nsp16 の他の重要な残基はよく保存されており、保存スコアは 6 ～ 8 (ピンク) でした。調査した残基の中で、K38 はスコア 1 (ターコイズ) の非常に変動性の高い残基でした。 nsp16のA83およびM247は、中間的に保存されているか、または可変でした（白から青緑色まで）（図S34b）。 7つのCoV間のnsp14の多重配列アラインメント分析により、nsp14のL7、F8、P20、A23、V40、およびF60が同一の残基であることが示された。 nsp14のV4、Q22、P24、T25、C39、D41、K61、M62、N63、T127、およびI201は同様の残基でした（図S35a）。 L7、P20、A23、T25、および F60 は、nsp14 でスコア 9 の高度に保存された残基でした。 F8、C39、V40、D41、K61、M62、N63、および T127 はよく保存されていました (スコアは 6 ～ 8)。 nsp14のV4、Q22、P24、H26、Y64、D126、T131、I201、D41は可変残基であった。 T21は中間残基（スコア5）でした（図S35b;表S12）。また、CoV全体でのnsp10タンパク質の保存分析の結果を図S36および表S12に示します。

この研究では、特に nsp14 と nsp16、およびそれらの共通の重要な補因子である nsp10 の役割に焦点を当てて、RTC の PPI を検討しました。 nsp10とnsp14およびnsp16の両方との相互作用は、CoVの生存と病因における中心的な活性化役割を実証しました（図1a）。これら 2 つの PPI をターゲットにすることは、いくつかの側面で重要です。 CoV のゲノムのサイズは大きいため、ExoN 活性の要件が正当化されます。ヌクレオチドを正確に選択する RdRp の能力は複製忠実度を提供するには不十分であり、nsp14 ExoN 校正活性の重要性が確認されています 74。 nsp14 と nsp10 の相互作用は、その ExoN 活性を in vitro で最大 35 倍強化します 75。さらに、SARS-CoV-2におけるキャッピングプロセスの最終段階（図1b）への干渉は、複製、翻訳、およびウイルス回避メカニズムをブロックする可能性があります。研究では、SARS-CoV26 およびマウス肝炎ウイルス (MHV) の nsp10 に由来するペプチドによる、CoV における nsp16 の酵素活性の阻害が示されています 27。

ワークフローの開始点（図S3）でペプチド阻害剤を設計するために、nsp10とnsp14 ExoNおよびnsp16 2'-O-MTaseとの相互作用を媒介する重要な残基を予測しました（図2および表1）。 nsp14 のすべての重要な相互作用残基は、その ExoN N 末端ドメインに向かって広がっていました。これは、nsp10 が N7-MTase の活性化に関与していない可能性があることを示しており、また、nsp14 ドメインの別の役割も明らかになっている可能性があります。これらの結果は、加水分解分析 76 および生化学分析 77 によって nsp14 ExoN と N7-MTase の独立した機能を示した研究と一致していました。さらに、MD シミュレーションの結果は、ヒンジ領域が nsp14 の 2 つのドメインを分離していることを示しました。さらに、これらの領域の高い柔軟性は、PPI を媒介する役割を反映している可能性があります。ループの動的な性質により、nsp10 の N 末端と C 末端の両方のループは、他の残基と比較してより高い柔軟性を示しました。重要なことに、これら2つのPPIの主要な相互作用残基の比較により、nsp10の24残基がSARS-CoV-2のnsp16およびnsp14の両方と相互作用することが示された（図2c）。変異誘発および BRET 分析も、SARS-CoV78 における nsp10 の重複相互作用をマッピングするために使用されています。これらの重複する重要な相互作用残基のユニークな特徴は、1 つの阻害剤 (OLP) で 2 つの重要なタンパク質 (nsp16 および nsp14) を標的にするための窓口として機能します。 Bouvet et al.78は、「ミューテーター表現型」と呼ばれるnsp10のK43AおよびY96F変異がSARS-CoV変異で上昇することを示した。さらに、nsp10 変異は ExoN 活性化を減少させるか、または停止させました 75。 CAS 分析の結果 (図 S9) はこれらの報告と一致しています。研究では、CoV における nsp14 ExoN の不活化により複製の忠実度が最大 20 倍緩和され、ExoN 活性の欠如により RNA 変異誘発の存在下での致死変異誘発に対する感受性が向上することが示されています 79。 SARS-CoV-2と他のCoVの間の界面およびホットスポット残基の類似点と相違点の説明（図S6〜S8）は、起こり得る新たな新型CoVへの将来の備えに貢献するでしょう。さらに、この研究は、重要な相互作用残基（図S8）とその相互作用マップ（図S17）を予測し、最近報告されたHCoV-OC43の構造について保存解析（表S12）を行った最初の研究です。 nsp16-nsp10複合体33。

大きな界面領域は、nsp14-nsp10 および nsp16-nap10 複合体の形成時に埋められました。したがって、多数の重要な相互作用残基を有するこれらの大きな界面領域は、小分子の代わりに干渉ペプチドによってこれらのPPIを標的化していることを実証した。低分子は、元のパートナー (nsp10) の相互作用と競合するために、これらの大きな領域に参加するという課題に直面しています。さらに、残基相互作用のマップにより、複雑な水素結合と疎水性相互作用が明らかになり（図S14）、小分子とのこれらの疎水性相互作用を標的とすることはより困難であり、ありそうもないことさえある可能性があることを示唆しています。一方、nsp10 と比較して設計されたペプチドのサイズが小さいと、界面での濃度が効果的に高くなり、その結果親和性が向上するため、競合結合に利点が得られる可能性があります。

次に、PPI 分析の結果に基づいて、SARS-CoV-2 の RNA キャッピングおよび校正機構を標的とするペプチド阻害剤がコンピューターによって設計されました (表 S6-S8)。次に、設計されたペプチドを評価しました (表 S9)。 OLP の中で、OLP-18 (NCVKMLCT) と OLP-13 (NCVKML) は最も低いドッキングスコアと結合エネルギーを示し、相互作用において多数の重要な標的残基と関与し、適切な結合ポーズと許容可能な特性を示しました。ペプチドとタンパク質の相互作用はほとんどが疎水性であり（図4）、天然の相互作用（図S14）と同様でした。 nsp16 が標的タンパク質である場合、設計されたペプチドのペプチド長と結合自由エネルギーの間に一般的な相関関係はありませんでした。しかしながら、nsp14が標的である場合のペプチドの結合自由エネルギーは、ペプチド長と直接の相関関係を示した(表2)。さらに、分析されたすべてのペプチドの HADDOCK スコアは、ネイティブ相互作用の HADDOCK スコアよりも高かった。したがって、ネイティブパートナー（nsp10）よりも近いまたは低いΔG結合でより強く結合するペプチドを同定するために、設計されたペプチドがインシリコ飽和突然変異誘発分析によって最適化され、ペプチドの新しいライブラリーが生成されました（表S10）。このコンピューターによる突然変異解析を使用して、最も正のΔΔGAffinity を持つ置換が明らかになりました (図 6 および S33)。最終候補として挙げられたこれらの変異体は、この研究で説明されている方法を使用して新たに設計されたペプチドを評価することにより、新しいラウンドの相補的な計算研究を開始します。さらに、保存分析により、設計されたペプチドと相互作用する標的残基の保存が明らかになりました（図S34およびS35;表S12）。したがって、標的残基の保存された性質によれば、設計されたペプチドは汎コロナウイルス阻害剤として機能する可能性があり、新たに出現する可能性のあるCoVに対して有用である可能性があります。さらに、この研究で報告された環状ペプチドは、さらなる計算研究の価値があります。

MTase 反応の副産物としての S-アデノシル-1-ホモシステイン、シネフンギン、およびアウリントリカルボン酸 (ATA) が、CoV の nsp16 基質結合阻害剤として同定されました。 SAM は、さまざまな宿主細胞の MTase によってメチル供与体として使用されます。 SAM 結合部位阻害剤は宿主の 2'-O-MTase 活性に影響を与え、細胞毒性効果を引き起こします 80。この研究では、独特のウイルス相互作用部位が標的とされました。したがって、設計されたペプチドは、SAM 模倣物よりも選択的で完成度が高い可能性があります。我々の知る限り、新型コロナウイルスに対するnsp14ペプチド阻害剤は現在利用可能ではなく、この研究は計算による最初の取り組みとなる。 nsp14-nsp10複合体によってRNA基質からグアノシン類似体としてリバビリン5'-一リン酸が切り出されることは、CoVに対するリバビリンの活性が低いことを説明する。 ExoN 不活化を伴う nsp14 のミューテーター表現型では、リバビリンは 20081 を示し、レムデシビルは 4.5 倍の感度増加を示しました 82。これらの研究と並行して、ここではヌクレオシド類似体（NA）とこの第一世代のnsp14設計ペプチド阻害剤との併用療法が提案されている（図7）。ペプチドの制限に関係なく、この提案された戦略は検討する価値があります。さらに、提案された治療法は NA の抗ウイルス効果を補完すると予想され、RNA 複製と RNA 校正機構の両方の阻害を引き起こす可能性があります。さらに、RdRp 変異の結果としてレムデシビル耐性が生じた場合、設計されたペプチドは耐性のリスクを高めることなくレムデシビルの有効性を高める可能性が高いと想定されています 83。しかし、分子的および生化学的な観点のいくつかの重要な側面はまだ不明であり、設計されたペプチドにはさらなる計算および実験的研究が必要です。提案されたペプチドの in vitro および in vivo での活性を研究し、その特異性、有効性、および薬物動態を評価するには、さらなる研究が必要です。さらに、設計されたペプチドを新型コロナウイルス感染症患者の有望な治療薬として検討する場合、FDA84によって最近承認されたペプチドと同様に、その送達システム、特に皮下または静脈内などの好ましい投与戦略を調査することが提案されます。また、宿主免疫を回避するために、インビトロ転写（IVT）mRNA を使用して、新型コロナウイルス感染症患者でペプチドを生成することもできる85。

ヌクレオシド類似体 (NA) と nsp14 ExoN 設計のペプチド阻害剤の併用療法に提案された戦略を示す概略図。リバビリン、レムデシビル、または他の NA と、この研究で設計された nsp14 ExoN ペプチド阻害剤との併用療法は、NA の抗ウイルス効果を完成させ、RNA 複製と RNA 校正機構の両方をブロックすることが提案されています。

新型コロナウイルスは長年にわたって人間の呼吸器症候群の原因となってきた。近年、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の世界的なパンデミックにより、医療と経済に多くの困難が生じています。これは、ワクチンや治療薬の開発において、感染率の高いSARS-CoV-2の構造的および分子的基盤を研究することの重要性を浮き彫りにしている。受容体認識に加えて、RTC の各ポイントと nsps の顕著な PPI を研究することで、固有のウイルス相互作用部位を標的とする可能性のある、ペプチド阻害剤のような特定の干渉抗ウイルス薬の設計につながります。キャッピング活性を有するnsp16-nsp10と、校正活性を有する複製の守護者であるnsp14-nsp10との間のタンパク質間境界面の重複により、これらのPPIは、CoVに対する抗ウイルス薬を設計するための標的として有望となっている。 SARS-CoV-2 cap-1 形成ステップを妨害すると、2'-O-MTase 活性が妨害され、ウイルスの mRNA が重要なタンパク質センサーの影響を受けやすくなり、ウイルス感染に対する最も初期の免疫応答が開始される可能性があります。トール様受容体 (TLR)、レチノイン酸誘導性遺伝子 I (RIG-I)、黒色腫分化関連タンパク質 5 (MDA5) などの細胞センサーは、最初のヌクレオチドの 2'O-メチルを欠く RNA を認識し、シグナル伝達を誘導します。サイトカインと I 型インターフェロン 16 の発現と放出をもたらすカスケード。この研究は、SARS-CoV-2および他のCoVにおける二重補因子としてのnsp10とnsp16 2'O-MTaseおよびnsp14 ExoNとの相互作用を媒介する重要な残基に関する包括的な情報を提供するものであり、現在または他のCoVと戦うための新しい治療法を設計するのに役立ちます。将来のCoV。 PPI の結果は、相互作用する 24 個の残基がこれらの複合体の PPI 界面に共通していることを示しました。したがって、二重の阻害力を持つ OLP が設計、評価され、最適化されました。標的の主要な残基の予測された保存は、汎コロナウイルス阻害剤の設計に新しい方向性を提供します。現在の研究で得られたペプチドの開発と最適化に成功する取り組みにより、これらのペプチドは、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）または将来起こり得る関連感染症の流行の治療のための新世代の抗ウイルス薬候補となる可能性がある。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。

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図は BioRender (https://biorender.com/) で作成されました。図 1a と 7 は、それぞれ BioRender.com (2022) による「推定コロナウイルスレプリソームのモデル」と「レムデシビル: 新型コロナウイルス感染症の潜在的な再利用薬剤候補 (ポートレート)」から採用されました。 https://app.biorender.com/biorender-templates から取得。

イスファハン大学、生物科学技術学部、細胞分子生物学および微生物学科、イスファハン、イラン

ファテメ・アラビ＝ジェシュヴァガニ、ファテメ・ジャワディ＝ザルナギ、モハマド・レザー・ガンジャリハーニー

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FA、FJ、MRG が研究を設計しました。 FAがデータを収集した。 FA、FJ、MRG は結果を分析し、議論しました。 FAが原稿を書きました。 FJ と MRG は原稿をレビューし、修正しました。

ファテメ・ジャワディ・ザルナギまたはモハマド・レザー・ガンジャリハーニーへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Arabi-Jeshvaghani, F.、Javadi-Zarnaghi, F. & Ganjalikhany, MR 二重標的阻害ペプチドの設計に向けた SARS-CoV-2 キャッピングおよび校正分子機構の重要なタンパク質間相互作用の分析。 Sci Rep 13、350 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-26778-8

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受信日: 2022 年 8 月 7 日

受理日: 2022 年 12 月 20 日

公開日: 2023 年 1 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26778-8

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